基因工程抗体
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第922页（5061字）
用分子生物学DNA重组技术改造制备而得的抗体，80年代在单克隆抗体(mAb)应用研究的基础上开始发展，为一种具有实际应用前景的生物技术。
自1975年杂交瘤技术的发展和应用以来，已有一系列与抗原呈专一性结合的单克隆抗体出现。由于mAb具有专一性优点，诱使人们将其应用于体内外研究和临床诊断治疗。在体外免疫化学特征和抗原定量方面的研究中，mAb显示出它的优越性；但在体内的应用上受到很大的限制。由于人－人杂交瘤细胞株的建立进展缓慢或者不稳定，现应用的mAb大多数是用小鼠或大鼠杂交瘤细胞株制备的，而鼠蛋白对于人体来说是异源蛋白，临床病人接受1～2次治疗即引起人抗鼠抗体反应。
虽然，将小鼠免疫球蛋白的可变区蛋白和人的免疫球蛋白的恒定区蛋白偶联，可减低其对人体的免疫原性，但这需要制备大量蛋白进行分离提纯和偶联，即费时又昂贵。70年代末分子生物学DNA重组技术的发展，80年代免疫球蛋白的结构和重排机制的阐明，以及对免疫球蛋白氨基酸序列的了解，促进了基因工程抗体的研究和发展。
1983年V．T．Oi等用基因工程手段和杂交瘤细胞制备得完整的抗体，具有一定的功能。同年，A．Ochi等将克隆的免疫球蛋白的重链和轻链基因成功地在小鼠骨髓瘤细胞中表达出具有活性的免疫球蛋白分子，为后来的基因工程抗体研究打下了基础。
1987年Lee K．Sun等将抗癌相关抗原的单克隆抗体基因的可变区重链(VH)和轻链(VL)DNA片段，插入含有人C区基因DNA片段的哺乳类表达载体上，在小鼠骨髓瘤细胞中表达的产物具IgG功能，并能专一地与癌细胞表面抗原结合。
完整的免疫球蛋白是个大分子，分子量为150kd，在制备和应用上有一定的限度。免疫球蛋白的较小片段，分子量为12000～50000，不但保持有抗原结合活力，而且由于其能有效地浸入组织，易于从血清中排除，所以也利于应用。1984年S，Cabilly等和M．A．Boss等分别将抗体V区片段在E．coli中表达，但产物是非天然状态。
1985年C．R．Wood等在酵母菌中表达的抗体V区蛋白仅小部分具有功能。一直到1988年A．SKerra等才成功地在E．coli系统中表达了VH和VL链，并组装成具抗原结合活力的片段。同年，R．E．Bird等在重链可变区的cDNA 3′端与轻链可变区cDNA5′端之间，用一寡聚核苷酸连接，在E．coli表达系统中表达得单链多肽，并在细菌内折叠成含有重、轻链可变区的抗体，其大小为完整免疫球蛋白的1／6。
1985年基因体外扩增技术多聚酶链反应的出现，推进和加速了基因工程抗体的研究。
1989年R．Orland等首先采用PCR法，他们从1987年发表的V区基因氨基酸序列，找出小鼠免疫球蛋白重链和轻链中编码V区的核苷酸序列及其两边的保守区序列，以保守区序列为基础设计合成引物。根据PCR法中所需要的引物不一定要求与基因碱基完全配对，因而可在引物的适当位置上插入便于进一步构建质粒用的限制性内切酶酶切位点。从杂交瘤细胞抽提RNA，逆转汞合成cDNA用PCR法扩增后，酶切切取所需DNA片段，构建含有V区基因的表达质粒。1989年L．Sastry等先建立小鼠重链区专一的cDNA库，再用PCR法扩增，然后构建得能表达重链V区的表达质粒。
1989年E．S．Ward等用PCR法克隆表达VH基因，表达产物具有结合抗原的亲和力．故又称为单区抗体。PCR法的优点促发另一研究趋向，不通过杂交瘤技术，直接从致敏的动物脾脏或淋巴细胞抽提核酸，用PCR法扩增后克隆。
1989年E．S．Ward等从致敏动物脾脏DNA入手，扩增克隆重得VH表达质粒。L．Sastry等从致敏小鼠脾脏抽提总RNA，逆转汞为cDNA，再用PCR法扩增后克隆。
1989年M．Bruggemann等用转基因小鼠表达人抗体。D．J．Chiswell等在1992年第10期生物技术趋向杂志中介绍了近年来在剑桥开展的关于噬菌体抗体研究，即以噬菌体基因组为载体构建抗体表达系统。作者称此系统表达的产物为‘Coliclonal’抗体，并认为此技术可能比传统的mAb技术更有应用前景。
基因工程抗体产物是完整的免疫球蛋白还是免疫球蛋白片段，则依据实验目的和应用目标而定。
当进行免疫球蛋白结构和功能方面的研究时，需要完整的分子。因抗体的糖基化主要发生在重链的恒定区，糖基化与抗体介导的补体活化、抗体依赖细胞毒效应，以及抗体与Fc受体的结合有关。因此需要高水平表达系统。1990年C．A．Hasemann等用杆状病毒表达系统达到高水平表达完整的免疫球蛋白分子。
当所需要的抗体仅用来作为一个具有专一识别功能的分子时，只要保存有抗原结合位点，无需考虑糖基化问题，所以表达产品为抗体可变区片段即可。或者如1984年M．S．Neuberger等将Fab与一便于检测的酶活性部分的DNA片段构成重组抗体，其表达产物即有抗原结合活性，又保持酶的活性，可用于免疫分析。
近年来引起人们兴趣的是利用抗体片段构建重组免疫毒素表达系统。1989年V．K．Chaudhary等在抗人白细胞介素－2受体的单克隆抗体的FvDNA片段和部分绿脓杆菌外毒素基因间连接一连接肽序列构建质粒，在E．coli表达得单链抗体毒素融合蛋白，对带有白细胞介素－2受体的人细胞株具有强毒性，而对没有白细胞介素－2受体的细胞株则无毒性。
1990年V．K．Chaudhary等在上述工作基础上，从对卵巢癌细胞专一的、分泌OVB3抗体的杂交瘤细胞中抽提RNA，采用PCR扩增法扩增后克隆，将含编码重、轻链的DNA片段与连接肽序列连接后克隆到含有部分绿脓杆菌外毒素表达载体上，在E．coli表达得重组单链免疫毒素，能结合或杀死带OVB3抗原的细胞。
上述的嵌合抗体或抗体片段产物中的整割V区是鼠源的，所以对人类仍存在不可避免的异源蛋白的影响。
展望未来，也是近期有关学术讨论会议的中心议题是如何避免人抗鼠抗体反应。人化抗体的研究可能是解除异源蛋白影响的途径之一。
早在1986年P．T．Jones等根据抗原结合位点主要由V区基因中超变区编码的。免疫球蛋白超变区结构与抗原结构互补，故称之为互补决定区(Complementarity determining regions，CDRs)。
他们尝试将鼠抗体上的CDRs移植到人抗体相应的CDRs位置，结果仍显示与抗原结合的活力。作者推断此CDRs替代法可作为从相应的鼠单克隆抗体构建人单克隆抗体的方法。1988年L．Riechmann等将鼠抗人抗体重、轻链可变区6个超变区导入人的IgG1抗体中，称为整形抗体(Reshaping antibody)，能用于人血清治疗。
整形抗体即是用人工合成抗原决定簇的互补区的氨基酸序列，插入预定的人抗体V区框架区(Framework regions，FRs)，由于人的FRs与小鼠的FRs序列间有最大的同源性，FRs本身不与抗原分子直接结合，由而获得带有鼠型mAb上抗原结合位点氨基酸序列的人免疫球蛋白分子，即人化抗体。人化抗体研究中关链的问题是，如何使鼠CDRs插入人抗体V区后能维持CDRs的空间构型，否则会降低抗原结合活力。这或者通过筛选方法选择同源性较好的人抗体V区做为接受鼠CDRs的框架；或者鼠CDRs插入FRs通过定点突变法改变氨基酸残基，以获得活性较高的人化抗体；或者将鼠CDRs附近影响其空间构型的氨基酸残基一起插入人抗体V区FRs中。
伴随蛋白质工程技术、计算机分析以及分子克隆技术的发展和综合应用，人化抗体基因的克隆和表达会不断地得到发展和应用。
。【参考文献】：
1 Skerra A ,et al. Assembly of functrional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science,1988,240,1038～1041
2 Riechmann L,et al. Reshaping human antibodies for thera-py. Nature,1988,332:323～327
3 Better M,et al. Escherichia coli secretion of an active chim-eric antibody fragment. Science,1988,240:1041 ～1043
4 Orlandi R,et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction, proc Natl Acad Sci USA,1989,86 : 3833～3837
5 Ward E S,et al. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature,1989,341:544 ～546
6 Sastry L,et al. Cloniing of the immunoiogical repertoire in E. coli for generation of monoclonal catalytic antibodies: Construction of a heavy chain variable region - specific cDNA Library. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86: 5728 ～ 5732
7 Bruggemann M,et al. A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgeniic mice. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:6709～6713
8 Chaudhary V K,et al. A rapid method of cloning functional variable -region antibody genes in Escherichia coli as single - chain immunotoxins. Proc Natl Acad SCI usa,1990,87; 1066～1070
9 Hasemann C A,et al. High -level production of a functional immunogllobulin heterodimer in a baculovirus expression system. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:3942～3946
10 Chiswell D J, et al. Phage antibodies: Will new coliclonalantibodies replace monoclonal antibodies? Trends in Biotechnology, 1992,10;80～84
(中国科学院上海细胞生物学研究所张玉砚研究员撰)