植物抗病基因工程的研究进展
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第981页（7263字）
植物病害数目多达数百种，几乎所有作物在生长期内都会遭受到不同程度的危害。
就主要作物之一的水稻而言，每年遭受病害的损失就达数十亿美元。怎样有效地防治植物病害，减少巨大损失，满足日益增长的世界人口需求，是农业生产上的当务之急，而防治植物病害的根本途径归根到底依赖于培育抗病品种。采用常规方法进行抗病育种，不仅受到物种间的限制，而且要固定一个抗病性状进入栽培品种费时巨大，常常需要10年之久，何况要寻找一个具有独立抗病性状的物种也是非常困难的。现代生物技术的发展，使得将外源抗性基因导入栽培品种，赋予其特定抗病性成为可能，从而大大加速了抗病育种的进程，开辟了抗病育种的新时代。目前针对单链RNA病毒，采用的外壳蛋白基因途径比较成熟，一些重组植株已进入大田试验，可望在20世纪末应用于农业生产；而针对不同病菌(细菌、真菌)的固有特性，采用不同策略的抗病基因工程正在发展中，可望近期内有所突破。
抗病毒基因工程
1．外壳蛋白途径。
1986年Beachy研究小组首次将烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因(CP基因)导入烟草，培育出抗TMV的烟草植株。开创了抗病育种的新纪元。
至今采用这一途径，针对黄瓜花叶病毒(CMV)，苜蓿花叶病毒(ALMV)，马铃薯X病毒(PVX)，马铃薯Y病毒(PVY)，烟草线条病毒(TSV)，烟草脆裂病毒(TRV)，水稻条纹叶枯病毒(RSV)等主要病毒，成功地构建出各种抗病毒工程植株。
这些表达病毒外壳蛋白基因的植株其抗病程度与细胞中该基因的表达水平一般成正比，即外壳蛋白基因的表达水平越高，其抗病力越强。进一步试验发现转基因植物还能交叉保护其它株系或相关病毒的侵染；田间试验表明这些工程植株的抗病性与室内相当，农艺性状与对照无明显差异。Nelson等对转TMV CP基因的重组番茄进行田间试验，结果对照几乎100%都发生症状，果实减产26%～35%，而转基因番茄(VF36)发病率仅为5%，产量几乎不受影响；同时他们还发现，表达TMV的UICP基因的重组番茄能交叉保护TMVmPV230的3个强株系的感染。
这些结果都显示出外壳蛋白途径在农业生产中防治病毒病的潜在威力。第一批转基因烟草经历了室内、温室、田间试验后，在1995年前后将应用于大田生产。
2．其它途径。除了外壳蛋白这一有效途径外，近来还开创出多种抗病毒基因工程的新方法。
1986年Baulcome等成功地将CMV卫星RNA导入烟草，获得的表达全长序列卫星RNA的工程烟草植株，对该病毒或相关病毒的复制和症状表现有抑制效果。1988年，Yamaya等获得了表达TMV弱毒株完整基因组的工程植株，这种植株生长正常，不表现明显症状，而对TMV有交叉保护作用，且其保护作用比表达外壳蛋白植株的强。
但是上述这2种重组植物都成了病毒“贮存库”，弱毒株、卫星RNA都有突变成强致病力株系的危险，因此有必要构建缺失突变株才能很好地克服这些潜在缺陷。1990年，Golemoboski等将TMV ul株系的非结构基因(54KD基因)导入烟草，获得了对TMV免疫性抗性的工程植株，引起了人们对病毒非结构基因的极大兴趣。
但54KD基因重组植物的比较专一的获得抗性若变得广谱一些，在农业生产的应用价值会更大。
以上是利用病毒基因组的有用基因的研究，抗病毒基因工程的有用基因的另一部分是来自植物等生物体的基因，例如病毒复制抑制因子、致病相关蛋白、抗体、核酶的基因等。其中致病相关蛋白工程已获得了重组植株，只是抗性不理想；而病毒复制抑制因子、抗体、核酶等工程的设想很好，展现出许多诱人的前景，但目前还处于起步阶段，还有一些需要解决的技术难题。
采用基因工程使植物获得抗病毒性能有多种途径，归结起来，基因的来源有来自病毒本身的，也有来自植物等生物体的；其作用机制有影响病毒复制的，也有影响其转移的，但至今还是利用病毒外壳蛋白基因策略的效果最好。
尽管如此，这种转基因植株也只是迟延一年生植物的病毒病的发生，而且目前能转移基因的主要是RNA病毒，因此植物抗病毒基因工程还有许多问题有待解决。
抗病菌基因工程
1．单一基因控制的抗性。植物病原细菌、真菌具有细胞结构，且侵染致病机制复杂，这就给用生物技术来防治这二大类病害带来了困难。植物与病原菌相互关系的分子基础研究，为用基因工程技术培育抗病菌工程植株积累了知识，目前抗病菌基因工程已经展开，并取得了一些有意义的进展。
烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv．tabaci)侵染烟草叶片后，产生一种细菌毒索即烟毒(tabtoxin)，干扰寄主细胞代谢并间接影响叶绿素的合成，形成野火病症。日本人率先从该菌中分离出解毒基因，并导入烟草，获得的重组植物能降解该菌分泌的烟毒素，不形成病班。
最近Herrera-Estrella等报道了类似的结果，他们将抗phaseolotoxin基因导入烟草，获得了耐phaseolotoxin、并抗该菌侵染的工程烟草植株。针对病原菌的致病毒素，克隆解毒基因采用基因工程技术来培育抗病品种是抗菌工程的可行途径。
但是针对寄主特异性毒素，从其分泌菌中分离其解毒基因的努力，多年来却未能如愿以偿，确是一件遗憾的事。
水解酶尤其是几丁质酶在体外具有抑制病原菌生长的生物活性。1991年，Broglie等将蚕豆的几丁质酶基因与强启动子CaMV35S连接，在烟草和芜菁中得到了高效表达，获得的抗性植株显着抑制病原真菌(Rhizoctonia solani)的生长，延迟了立枯病的出现。蚕豆与烟草的几丁质酶性质有所不同，如底物特异性、Vmax和Km、稳定性等，也许正是由于病原菌与所不熟悉的丁质酶相遇才导致植物抗病性的出现。
将烟草的碱性液泡几丁酶基因转入近缘种的烟草中，虽然获得了高效表达，却没有表现出对Cercospora nicotianae的有效的保护作用。
核糖体灭活蛋白(RIP)来自植物，是一类作用于真核生物细胞核糖体、抑制蛋白质合成的蛋白毒素。
RIP不灭活自身的核糖体，却能特异性地作用于亲缘关系较远的种类，如真菌的核糖体。
1992年，Schell等将受控于伤诱导启动子的大麦RIP cDNA导入烟草，获得能抗土壤病原真菌Rhizoctonia solani的重组植株。
在此例中，外源RIP在寄主细胞中未表现出毒性，转基因烟草仍能生长、传代。但RIP对宿主细胞的潜在毒性依然存在，这一点要特别注意，这是确保RIP在作物防卫中的成功应用的关键。
在策略上可以通过使RIP分泌到胞外或液泡中，或是设计成诱导型表达，来减轻RIP产生的宿主毒害作用。另外，几丁质酶和葡聚糖酶具有降解真菌细胞壁，抑制真菌生长的功能，如果RIP与这两种酶协同作用，也许会显着提高抗菌或抗病能力。
抗性基因不仅来自高等植物和病原菌，例如，来自牛的溶菌酶，在体外对多种革兰氏阳性菌和阴性菌有抗性，包括农杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等的一些植物病原菌。初步实验证实，让牛的溶菌酶基因在烟草中表达，对野火病菌的侵染有一定的抵抗作用。
寻找抗菌基因进行抗病基因工程是一项长期而艰巨的任务。作者等曾从对水稻白叶枯病菌拮抗作用很强的芽孢杆菌中纯化出几种抗菌蛋白，将编码这些抗菌蛋白的基因导入水稻制作重组植株的工作还在进行中，效果如何倍受关注。
2．多基因控制的抗性。植保素(phytoalexin)和木质素在细胞内的积累或在细胞壁上的沉积直接表现为抗病效应，而它们的生物合成和沉积过程是受多基因控制的。弄清其生物合成途径，找出协调多个相互独立的防卫基因的调控基因，是调控多基因防卫系统，提高抗病效果的关键。PAL(phenylalanine ammonialyase)是合成木质素单体以及某些植保素(pterocarpans and furanocoumarins)的关键酶。对含PAL基因的重组植物的分析结果表明，PAL基因表达水平高的植物中phenylpropanoid积累和抗菌活力都得以增加；此外，表达peroxidase基因的重组烟草体内不仅该酶的活力大大增加，而且还增加了对Peronospora parasitica的抗性。
植物病原菌常常不能耐受非寄主植物的phytoalexin，因此，让病原菌与非寄主的phytoalexin相遇，是提高植物抗性的又一条新路子。
将花生的stibene基因导入烟草，结果在烟草中合成了新的phytoalexin resveratrol。但是，还未见这种新的phytoalexin对提高抗性的效果究竟如何的报道。
近来不少研究进行了这方面的探索，这不仅在抗病育种方面有重要价值，而且是对研究phytoalexin生物合成机制的贡献。
位于植物细胞壁中的负电性过氧化物酶(peroxidase)，能催化产生酚基以形成木质素的氧化型聚合物，另外也可能参与与保卫机制有关的胞壁结构蛋白交联反应。往烟草中导入番茄的过氧化物酶基因，在其自身的启动子或CaMV35S启动子的控制下过氧化物酶活性大大增加，同时也加强了对Peronospora parasitica的抗性，抑制了病症的发展和病原真菌的孢子形成。
在植物抗病保卫机制被激活的初期，信号的识别和传导是非常重要的。
已经发现，十八肽systemin是在植物受伤后诱导全株性保卫机制的信号分子；而水杨酸则是由过敏性环死引发全身性保护反应的信号传递因子，它在烟草内的受体是一种约650KD的可溶性多聚体。在信号传导与信号响应过程中，常伴随着胞内外离子浓度的改变。当植保素被激发合成时，先出现氢离子的内流和钾离子的外流，随即出现钙离子内流，导致胞液中植保素含量增加。进一步弄清其内在机制，对开辟新的抗病工程途径尤为重要。
抗菌基因工程经历几年的徘徊之后，终于走出了低谷，近来常可见到一些成功的报道。只要加强植物与病原菌相互作用的分子基础研究，加强重组植物中抗性基因跟踪分析，就一定能用生物技术制作出能在农业生产上应用的抗病原菌的重组植物新品种。
我国的现状及存在问题
1．现状。80年代中期特别是实施863计划以来，根据Beachy的外壳蛋白途径，以流行于我国的主要农业病毒为材料，克隆外壳蛋白基因，进行抗病毒工程，培育出抗TMV、CMV等病毒的工程烟草植株，目前已进入规模大田试验；与此同时也成功地构建出能表达CMV卫星RNA的重组植株，也表现良好的抗CMV特性，这些都大大缩短了我们与世界的距离。在抗细菌病基因工程方面，我们把精力集中在抗菌蛋白途径上，纯化出一批抗菌蛋白，可至今未见有表达抗菌蛋白的重组植物的报告。在抗真菌病基因工程方面进展不大，有待进一步加强。抗病基因工程研究不仅可以为农业生产提供具有特定抗病性的品种，而且是植物与微生物相互作用分子基础研究、分子生物学、基因工程方面综合国力的显示，因此有必要进一步加强。
2．存在问题。
(1)基因工程与基础研究。近几年来我们习惯于运用基因操作技术，以我国的生物资源为材料，克隆国外已有的基因，这对赶上世界水平起到了一定的作用。但我们不能满足于此，必须基础研究与基因工程并重。在进行基因工程的同时加强基础研究，深入研究植物与微生物相互作用的分子基础，去创造新的抗病途径；深入研究重组植物的抗病机制，去发展现有的抗病途径。
只有这样我们的研究才真正有生命力。否则的话与世界缩短了的距离还会拉大。
(2)基因工程与常规农业技术。采用基因操作获得的只是一种人工种质新材料，而不是生产上可以立即应用的新品种。
必须经过常规的育种程序，将重组植物的外源基因稳定延续给后代或通过有性繁殖转移至其它品种，此后该品种还必须在合理的栽培措施的紧密配合下，才能实现最终价值。
运用基因工程技术进行的抗病育种，并不是一个单一的技术，而是多学科(分子生物学、基因工程、植物病理、遗传育种、组织培养等)的紧密合作才能完成的工作。
必须将生物技术与传统技术合理配合，科学组装，才能有效地解决农业生产中的问题。(3)基因工程与环境生态平衡。
前几年由于遗传工程生物体野外试验法规尚不健全，重组植物很容易进入大田试验，这为我国在这方面的研究赶上世界水平开了绿灯。但基因工程技术在带来明显经济利益的同时，亦有可能带来一些潜在问题。我国是一个农业大国、一个发展中的国家，还是要有个法规，加强管理，以防万一。
固然作物的生长位置较为固定，且多为一年生植物，加之目前导入的几乎都是单基因，但并不等于就没有问题。
对特定的基因工程生物体在非受控条件下可能造成的生态后果必须加强研究，作出较可靠的预测及综合的生态评价后，再在农业生产上推广应用。
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(清华大学刘进元教授、余荔华博士撰)