果实成熟的生物化学和分子生物学研究

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1037页（4852字）

果实成熟是指果实停止增大和增重以后，由于内部生理生化变化而导致果实成为可食用状态的过程。

过分成熟的果实易受机械损伤和病原菌的侵染，造成经济损失。因此，果实成熟和延缓衰老的研究具有理论意义和实用价值。

20世纪20年代末，英国金德和威斯特(F．Kidd& C．West，1922)开创了果实成熟生理的研究，侧重于成熟过程中果实颜色、质地、风味的变化与果实呼吸的关系。1928年，布拉克曼(F．F．Biachman)提出结构组抗学说，认为在未成熟的果实组织中有一种天然组织抗，使果实保持鲜嫩状态，当组抗降低时果实开始过渡到成熟和衰老；组抗大的果实合成代谢与降鲜代谢保持平衡；组抗降低时降鲜代谢大于合成代谢，果实对病菌的免疫能力也随之降低，其表现为淀粉降解和糖化，叶绿素分解失绿，细胞壁变薄，果实软化，原生质膜透性增强，果实褐变和出现病菌感染斑点。塞彻(J．A．Sacher，1966)观察到组织中自由空间增大，支持结构组抗的假说。普拉特(H．K．pratt、1969)提出乙烯是果实成熟的启动子之后，布雷迪(C．T．Brady，1970)报道，当果实成熟时膜脂成分和物理性质发生改变；勒里(S．Lurie，1983)等报道苹果磷脂在跃变高峰时减少，膜脂中固醇与磷脂的比值较跃变前增大。

许多文献报道(S．F．Yang，1984等)果实成熟的一切代谢过程几乎都与乙烯有关．无论内源的或外源的乙烯都能诱导呼吸跃变期提前出现退绿和新色素的形成；乙烯还诱导芳香类物质的释放和使果实软化。

玛普桑(L．W．Mapson，1969)采用气调法贮存果实，就是通过降低贮藏室的氧分压和提高二氧化碳分压吸去乙烯来控制果实成熟、延长果实供应时间的。

索洛莫斯(J．Solomos，1978)观察到乙烯和氰化物都有诱导马玲薯呼吸跃变出现的作用，同时都能提高酶解途径中FDP和TP含量，降低G6P，．3－PGA和PEP含量，以加速糖酵解的速度。(J．B．阿丹斯1981)和罗恩(K．S．Rowan)同样观察到鳄梨和香蕉在呼吸跃变上升时G6P，FDP下降。

查尔默斯等(D．J．Chalmers，1971)认为PFK是番茄果实呼吸跃变上升的调节者。80年代的研究资料表明，焦磷酸－果糖－6－磷酸转移酶(PFP)对呼吸跃变的上升起调节作用。

本纳特(A．B．Bennett，1987)观察到鳄梨成熟时PFK和PFP在各阶段均存在，但当F₂，6P₂存在时PFP的活性增强10倍，同时PFK和PFP活性相似，在跃变高峰出现的一瞬间F₂，6P₂含量增长比跃变前期高80%～90%，因此认为果实成熟时呼吸增加为PFP活化，而PFP又为F₂，6P2激活。斯蒂特(M．Stitt，1966)证明胡萝卜和马玲薯用乙烯处理后F₂，6P₂大增。1980年，富勒和尤伊达(E，furuya & K．Uyeda)用鼠肝证明F₂、6P₂是PFK的活化因子。

最近的研究资料表明，植物细胞质中F₂、6P₂的靶酶是PFP，F₂、6P₂有激发PFP活性的作用，而PFP可代替PFK，因而认为在呼吸跃变中PFP起很重要作用。

1989年，吴敏贤等关于香焦成熟中PFP作用的研究资料同样证明，在跃变期PFP活性比PFK约高5倍，P₂、6P₂在跃变上升期高21倍，此时PFK提高2．5倍，认为PFP的活性为组织中F₂、6P₂浓度调节，后者与酶的结合及其活性受酶的底物F6P和温度调节，但PFK活性受ATP浓度的调节不受F₂、6P₂的影响，认为PFP对果实成熟具有重要的生理作用。古登奥夫(U．W．Goodenough，1972)指出，番茄在呼吸跃变时CO₂的产生与苹果酸代谢明显相关，当果实成熟时苹果酸由积累变成消耗，这一过程与柠檬酸合成酶和苹果酸脱氢酶下降有关，同时证明在番茄果实中存在与NAD连接的苹果酸脱氢酶，它位于线粒体内膜上，同时存在与NADP连接的苹果酸酶，它位于线粒体外膜上。1990年又发现成熟的番茄．NADP——苹果酸酶活性在采后两天的绿熟果中为0．69m molNADP分^－1，鲜重^－1．蛋白^－1，4d(始红期)仅为0．23m mol，指出在番茄成熟时碳水化合物代谢在细胞质和线粒体中有交替性变化。实测结果表明，在绿熟期线粒体TCA运转产生2mol CO₂，细胞质脱羧产生1mol CO₂，现红始期TCA产生0．8mol CO₂，苹果酸脱羧产生4mol CO₂，全红期二者均产生0．8mol CO₂。1984年，吉弗里(D．Jeffery)将乙烯对番茄成熟过程中某些酶的影响分为3类：酶活性变化与乙烯作用无关的类型，如柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶其比活变化不依赖乙烯；乙烯不启动酶的合成，但加强酶的活性，如叶绿素降解酶；乙烯不但启动酶的合成，还提高酶的活性。早在1953年，米勒(L．A．Miller)将果实的呼吸跃变归因于线粒体解偶联作用。兰什(C．Lance，1967)证明番茄和鳄梨线粒体在整个呼吸跃变过程中均保持着完整性和偶联功能。近10年中关于果实成熟中线粒体的转能活性作了大量研究。

拜尔(J．B．Biale，1978)报道，鳄梨在呼吸高峰时R．C．和ADP／0也达到最大值，但被氧化的底物不同，效应也不同。以琥珀酸为底物时与成熟无关．以丙酮酸为底物氧化效率增大，此时加入TPP有增效作用。扬等(R．E．Young，1982)用P³²参入法研究资料表明，高峰期P³²参入磷脂的量比前期高10倍，由此认为磷酸化受体的亏缺是呼吸跃变上升的原因之一。

本纳特(A．B．Bennett，1987)用核磁共振技术(NMR)研究呼吸跃变与P³¹-NMR波谱的关系，证明β-ATP峰与呼吸跃变峰一致。

在跃变高峰时ATP比前期增加86%～94%。

果实成熟时的呼吸跃变机理虽已研究了80余年，但其实质仍未弄清。不少研究者指出，结构组抗的理论不能解释成熟过程发生的全部现象，成熟过程绝不只是物质的降解代谢，某些物质的合成作用也很活跃；质膜透性变化是成熟的结果，而不是诱发成熟的原因；免疫能力下降发生在成熟后期。休尔姆(A．C．Hulme，1954)观察到L－亮氨酸参入蛋白质的活动在呼吸上升期参入量最大。

马雷等(N．Marei et．al，1971)观察到无花果成熟过程中不仅有核糖体、RNA和蛋白质合成，还有DNA、25S、18SrRNA和5StRNA的新合成，并受乙烯的促进。因此，有人认为果实成熟是基因组按时空程序表达的结果。80年代初，英国格里桑(D．Grieson，1983)和美国莱蒂斯(G．Lati．es，1984)实验室分别研究了多聚半乳糖醛酸酶(PG)和纤维酶的基因表达。这两个酶的功能是使细胞壁降解，从而导致果实软化。

最近，格里桑和美国迪拉佩拉(D．Dellapenna，1990)证明PG是一个阶段专一性和组织器官专一性表达的酶，其专一mRNA是番茄成熟初期开始转录的，随着果实成熟酶蛋白急剧的增加，同时PG活性也随之增强。他们还分离、纯化了PG蛋白，确定该酶是有3个同工酶的糖蛋白，分子量为47kd的同工酶Ⅱ是降解细胞壁的主要酶。他们已获得PG的CDNA克隆和核基因组克隆及调节该酶表达的一段启动子基因，并作了序列分析，证明PG基因在该基因组内是一个单拷贝基因，全长74506P。

最近，格里桑等又将PG5′端1．45kb的完整启动子基因与CAT-NOS基因连接，构建成融合载体，将其转导到番茄细胞中，发现其再生的转基因番茄的成熟果实中具有CAT活性表达，而在不成熟的果实、叶片和根中没有CAT活性表达，表明PG具有成熟特异性表达的启动子。

1988年，格里桑和希海(R．E．Sheehy，1988)相继公布了他们构建成功番茄PG的反意RNA系统，即将PG反意基因接在CaMV35S和NOS3′基因之间，构建成双元载体进行转化，获得转基因番茄植株，从该植株获得的番茄红果其中PG活性下降99%。该番茄在常温下贮藏的货架寿命比普通番茄长4倍，证明利用基因工程技术可专一地抑制PG的表达。前面已经提到乙烯是果实成熟和器官衰老的重要激素。1990年，格里桑(D．Grieson)发现一种与伤乙烯释放有关的蛋白，分子量为3．5kd，并获得它的cDNA和核基因，测定了全序列。

利用反意RNA技术证实控制该基因表达可有效抑制果实成熟。

最近，西洛吉斯(A．Theologis，1990)等将乙烯合成的前体ACC合成酶的基因从番茄中克隆出来，测定了全序列，同时证明ACC合成酶基因为一基因家族，有5个拷贝，命名为LE-A_cC1IA、LE-A_Cc2IB、LE-A_CC3、LE-A_CC4和LE-A_CC5。其中，LE-ACCIA与IB之间的氨基酸同源率为95%，其余3个同源率为50%～70%，在果实中表达出两个同工酶，它们的cDNA氨基酸同源率为68%，分别命名为A_cc1和A_cc2，各自的CDNA克隆命各为PTA_cc2、PTA_cC4，编码的蛋白分子量分别为54．7kd和53．5kd。用反意RNA技术导入番茄其子代纯合子的乙烯释放量较对照者低99．5%，成熟比对照者慢，在常温下放90～100d不转红，表明用基因工程技术控乙烯合成可能有很大的应用前景。

。【参考文献】：

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(中国科学院植物研究所刘存德研究员撰)