蓝藻的固氮作用
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1048页（5896字）
研究蓝藻固氮的意义有多方面：(1)固氮量大，仅次于豆科植物－根瘤菌共生固氮系统；(2)能同时进行固氮和光合作用，集两大生理过程于一身；(3)蓝藻是原核生物中唯一进行光合放氧固氮的类群，在进化上占有特殊地位；(4)固氮时放氢，从能源开发角度说，它可能是一个有希望的太阳能生物转换系统。
现已查明，有分属于11个科30多个属的120多种蓝藻能够固氮。从形态学上分有异形胞蓝无异形胞蓝藻和单细胞蓝藻3类，分别在空气中和微氧或无氧下行自生固氮，其中有些种类还能和细菌、藻类、苔藓、蕨类、裸子植物甚至被子植物联合固氮或共生固氮。
1928年证实蓝藻能固氮。随后人们对固氮蓝藻的种类、生态分布和生理习性进行了调查。
40年代后集中在整体水平上对蓝藻固氮生理和生化进行研究。60年代初，随着体外非细胞固氮的成功，蓝藻固氮研究逐步进入分子生物学水平。
蓝藻固氮酶的特性 蓝藻无细胞制剂固氮研究几乎和巴氏芽孢梭菌同期进行。由于方法复杂，以致迄今对蓝藻固氮研究仍然没有像对自生固氮菌那样深入。
蓝藻固氮酶也是双蛋白系统，其米氏常数在0．002～0．006之间，有ATP时放氢，对氧十分敏感，其钼铁蛋白的分子量为220000，由分子量分别为52800和55000两种类型亚单位组成，等电点为4．72～4．99。铁蛋白由两个分子量同为30000的亚单位组成，一级结构测定已经完成，不含色氨酸。两种蛋白的氨基酸组成、epr等波谱信号和金属元素含量均与别的固氮生物相同。其钼铁蛋白可与棕色固氮菌的及多粘芽孢杆菌的铁蛋白重组固氮性，铁蛋白可与棕色固氮菌的、多粘芽孢杆菌的及深红螺菌的钼铁蛋白重组固氮活性，与巴氏梭菌钼铁蛋白重组的活性较低。
近来发现蓝藻中也有第2种甚至第3种固氮系统存在。目前关于蓝藻固氮酶学方面的报道不多。
蓝藻固氮的活性部位 绝大部分固氮蓝藻属于具有异形胞的一类。异形胞只有PSⅠ，不含锰离子和藻蓝素，不放氧，不同化CO2。
一段时期内曾有过蓝藻固氮场所为何的争议。认为异形胞是固氮部位的依据有：(1)异形胞的存在和蓝藻固氮能力有一定关系：(2)有结合态氮时蓝藻固氮和异形胞形成同时受到抑制；(3)异形胞具有固氮作用所需要的条件；异形胞具有固氮活性。
认为固氮部位不一定在异形胞中的依据是：(1)能固氮的粘球藻属于没有异形胞的蓝藻类型；(2)N2示踪法测得柱孢鱼腥藻的固氮能力比异形胞强；(3)无氮培养基中生长的固氮蓝藻有时异形胞数量并不多。现在对异形胞是蓝藻的主要固氮场所的争议不大，且进一步查明，异形胞固氮形成的氮化物中有5%～6%留在异形胞里，其余迅速以酰胺形式经过微孔输给营养细胞，而既有PSⅠ又有PSⅡ的营养细胞固定CO2形成的产物以麦芽糖形式也经微孔运给异形胞，两类细胞相互配合保证固氮的进行。但是，无异形胞的蓝藻固氮部位如何仍值得探讨。
蓝藻固氮和光合作用的关系 蓝藻固氮依赖于光，光合作用影响固氮酶活性和合成。
经用抑制剂、远红光和红蓝光处理以及异形胞和PSⅡ／PSⅠ活性比值相对高的蓝藻光漂白细胞为材料，证明蓝藻和PSⅠ直接联系，和PSⅡ的关系是间接的。但是，蓝藻细胞内还原剂最终还是靠PSⅡ供给，因此在一定条件下，作为光合产物的碳水化合物和ATP的还原剂库亦制约固氮。
光合形成的还原剂和电子通过还原的铁氧还蛋白(Fd)或还原的辅酶Ⅱ(NADPH)传给固氮系统。质体醌(PQ)也有可能作为非环式电子传递和环式光合磷酸化的辅助因素影响蓝藻的固氮作用。蓝藻固氮和光合作用之间的关系很复杂，其中需要研究的问题很多，如光合形成的能量和还原力在固氮、CO2还原、放氢以及其它生理过程之间的去向调节机制，固氮和光合作用的功能部位是否统一?光对两个过程是否同时起作用?两个过程的电子载体和供体是否相同?无异形胞的蓝藻光合产氧和固氮所需还原条件如何克服?有异形胞的蓝藻除了空间上隔离之外，有无别的方式?它们在时间和步序上的调控机制如何?都待阐明。
蓝藻固氮和光呼吸 耗氧的光呼吸也存在于蓝藻细胞中，它和固氮酶竞争还原剂。
低CO2、高O2和高强光都能促进光呼吸而降低固氮活性，因而抑制光呼吸乙醇酸代谢途径中乙醇酸氧化酶活性的抑制剂(如NaHSO3)可以降低蓝藻光下吸氧量从而促进固氮。光呼吸和固氮之间的联系机制依然不清，研究者也不多，应该予以重视。
蓝藻固氮的暗过程 蓝藻固氮本身是个暗反应。暗中固氮酶反应所需的还原剂来源有几种说法：(1)在某些情况下丙酮酸可促进固氮。根据在柱孢鱼腥藻中检测到丙酮酸、Fd氧还酶存在的实验资料认为，丙酮酸代谢的生理作用在于氮还原成氨时，所需的还原态Fd的量。但也有人报告说丙酮促进固氮的能力极微，因而认为其作为生理电子供体作用可能很有限；(2)戊糖磷酸氧化也可能是固氮的还原剂来源，它向暗呼吸提供NADPH以支持固氮；(3)三羧酸循环／乙醛酸支路则可能是为氮还原成氨提供碳架，间接支持固氮。基本上已确认蓝藻固氮中电子传递顺序为：NADPH2→Fd→NAD还原酶→Fd→固氮酶或丙酮酸→Fd→氧化酶→Fd→固氮酶。目前对蓝藻固氮暗过程研究进展不大，报告也少，理应深究。
蓝藻固氮和氢代谢 蓝藻的氢代谢指氢的吸收、循环再利用和氢的释放两个方面。第一，放氢。蓝藻在固氮的同时放氢。
从固氮效率来说，放氢是能量损失过程，但从开辟能源来说，则是一种生物产氢体系。
一般认为放氢是固氮酶催化的，其依据是：(1)它和固氮一样依赖于光；(2)固氮酶的天然底物N2抑制放氢；(3)CO不抑制放氢却抑制固氮；(4)NH4+及光合抑制剂和抑制固氮一样，也抑制放氢；(5)在有异形胞的蓝藻中放氢主要在异形胞中进行等。近来有资料认为，蓝藻中有一种称为可逆性氢酶的物质也参与放氢。
此酶对CO和O2敏感，不受N2和C2H2的影响，不需要ATP，缺钼时放氢减弱，细胞经光漂白后则增高。放氢的电子载体和供体的细节尚不清楚。由于放氢和固氮在很大程度上是固氮酶催化的，因此推测放氢的电子载体和供体与固氮应是一样的，而对非固氮酶以外的酶催化放氢中的电子传递情况还一无所知。
第二，吸氢。绝大多数实验资料确认，包括分子氢循环再利用在内的蓝藻所吸收的氢可以支持固氮，提高固氮效率，吸氢和固氮之间一般呈现同时起伏变化的关系。通常认为吸氢由氢酶催化。
吸氢酶有膜结合态和可逆而又是可溶性的两类。蓝藻中是否有不同氢酶参与吸氢，尚无定论。
迄今只见到膜结合态氢酶参与吸氢。
近年来有人报告认为固氮酶也催化吸氢，其吸氢能力常以固氮酶基质(N2，C2H2)为转移。
有两种利用氢的途径：一为通过呼吸途径的催化羟化反应，此反应不一定需光，以氧为末端电子受体，可为蓝藻固氮提供额外能量，并可除去固氮酶上多余的氧或积累的氢，保护该酶免受伤害；另一为通过光合链的Hattori反应，此反应在光照无氧下提供电子到PSⅠ，经Fd传给固氮酶以利固氮的进行。蓝藻的品系类别、藻龄、气体和培养基组成、金属元素镍和钼、光温条件等都制约吸氢。
氢代谢研究中需待阐明的问题很多，诸如参与氢代谢的酶类、氢代谢的途径和机制、氢代谢与包括固氮在内的其它生理生化过程的关系和调节，以及如何提高氢的利用效率和产氢率等等。
蓝藻固氮和氮代谢 蓝藻固氮生成氨基本上也是通过谷氨酰胺合成酶(GlnS)作用将氨基转移到谷氨酸上形成谷氨酰胺输出到异形胞中，而谷氨酸则来自营养细胞。
GlnS已从某些蓝藻异形胞中提纯出来，其活性受反馈抑制，Mg2+对其有调控作用，有些还受光的影响。尚未发现蓝藻中存在GlnS腺苷化反应，因此其参与固氮的调节机制可能和别的固氮生物有异。氨、谷氨酰胺、尿素、氨甲酰磷酸和硝态氮化物都阻抑蓝藻固氮酶合成，有些藻还受精氨酸的阻抑，天门冬氨酸则无效应。据研究，氨本身并不直接阻抑固氮酶合成，而是与氨代谢有关的某些产物才有此效应。
有人认为氨及其代谢物通过抑制异形胞分化调控固氮，而抑制固氮活性也主要是通过与固氮酶竞争ATP或还原力，并非直接调控异形胞中固氮酶的合成。此外，蓝藻固氮产物有部分分泌到胞外(主要是氨。也有酰胺、氨基酸、肽和某些生理活性物质)，分泌量约占总固氮量的20%～30%，高者60%～80%，共生条件下分泌氨多些，不受C／N比影响。分泌物也影响其自身固氮，可减少对固氮酶合成的阻抑。
蓝藻固氮酶合成及其调控机理是固氮研究中的热点之一，而氨及其化合物的释放还牵涉到蓝藻的生产应用效果，所以这方面的问题始终引起研究者们的注视。
蓝藻的固氮遗传 从生化途径探讨蓝藻的固氮遗传，由于研究方法不完善，进展不大。20世纪80年代，采用亚硝基胍、紫外线照射及转座子插入等诱变得到了一些nif－和het－(分化异形胞)的突变体，再加上基因转化、接合转移和异源DNA杂交探针等技术的广泛应用，人们对蓝藻固氮遗传才有了较多的了解。在基因转移方面，已有一些单细胞蓝藻可被转化，一种广宿主范围的接合性质粒RP－4能有效地在大肠杆菌与单细胞或丝状蓝藻之间接合，在PDS4101或PGJ28质粒协同下，它能转移含有PBR322质粒的蓝藻。
在固氮基因组成、结构和基因簇方面已发现：(1)在丝状蓝藻(如鱼腥藻)的营养细胞和异形胞中都有nif基因簇，一般情况下只有后者能表达。营养细胞染色体上的nif结构基因中nifD和nifH相连并共转录，nifK与nifD被11kb的DNA片段相隔，有自己的启动子，并有第2个nifH，其转录条件与nif基因相似。营养细胞分化为异形胞时有两处发生变动，一是切除介于nifD和nifK之间的无nif信息的11kbDNA片段时，nifHD和nifK即相连而并存于一个操纵子内，而切除下来的11kbDNA则形成环状分子存留于异形胞内；另一是nifHDK的右方有11对重复顺序的重排，nifS(或V)基因右侧25kb处的DNA亦发生取代作用。现在对调控这些nif基因重组的分子机理尚不清楚。
(2)nifV(或nifS)不在nifKDH下游，而在上游，它们的极性相同。鱼腥藻7120固氮酶结构基因nifKDH的核苷酸已进行顺序分析，其中nifH的顺序相当保守，nifK和nifD基因大小相似，核苷酸顺序没有同源性，但其α和β亚基中5个半胱氨酸的位置是保守的，nifK和nifH5′端的调节顺序中有两个共同顺序，其同源性可能在nifK和nifH-nifD的协调控制上起作用。在调控方面，发现在有氨或无氨条件下蓝藻都合成GlnS，但调节情况有异。有氨时，GlnS转录可为相距64000的两个启动子启动(其中一为nif启动子)，无氨的固氮条件下只用nif启动子。
外源氨只部分调控nif和het的表达，在某些蓝藻(如鱼腥藻7120)中nif的调控不依赖于ntr，nifA产物。
蓝藻固氮和农业生产 据统计，蓝藻所固定的氮量为16～89kg／ha，不仅对水稻有增产效应，对其它作物亦有益。
多年来，人们已在养殖方法和应用技术上取得一定的进展，但迄今蓝藻的肥效常不稳定。这除了由于蓝藻固氮产物氨不截留在细胞中或排到胞外的量少之外，与人们对蓝藻固氮的生理生化过程乃至分子生物学机制和调节的了解尚不透彻也有关系。
因此，必须加强蓝藻固氮的基础研究，同时也要探讨提高现有固氮蓝藻固氮效率的途径，寻找新的高效固氮蓝藻，扩大固氮生物资源。
。【参考文献】：1 Stewart W D P. Blue-green algae,A treatise on dinitrog-en fixation (Hardy WF et al eds) Section I Biology. Wiley, New York. :1977. 67～123
2 Tyagi VVS,et al. Dinityogen fixation by blue-green algae. Ann Rev. plant Sci. 1980,l:l～36
3 黎尚豪．固氮蓝藻作为晚稻肥源的研究．水生生物学集刊，1981，7：417～424
4 BotheH,etal. Physiology and biochemistry of N2-fixation by cyanobacteria. Advances in nitrogen fixation research (Veeger C et al eds), Nijholf/Junk, 1984. 199～210
5 Houchins J P. The physiology and biochemisry of hydrogen metabolism in cyanobacteria. Biochem Biophys Acta,1984, 768:229～255
6 陈因．蓝藻的固氮作用．生物固氮(尤崇构等主编)，北京：科学出版社，1987．266～294
7 曾定．固氮生物学．厦门：厦门大学出版社，1987．64～116
8 Stewart W D P. Some aspects of structure and function in N2-fixing cyanobacteria. Ann Rev Microbiol. 1988, 34:497～536
9 王业勤，等．蓝藻分子遗传学十年研究进展．水生生物学报，1991，15(4)：356～367
(中国科学院上海植物生理研究所陈因教授撰)