甜味蛋白

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1057页（2808字）

从一种叫Thaumatococcus daniellii Benth的热带作物的果实的胶质假种皮中分离出来的可食用的蛋白质，比蔗糖甜10万倍。

但移植在西非以外地区的模拟环境中T．daniellii不能产生正常的含甜味蛋白的果实。

生物学基础甜味蛋白是由一个基因家族编码的，已知最少存在5种蛋白产物：thaumatin Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，b，c。它们的分子质量均约为22ku，其中最主要的是两种：22．209ku的thaumatin Ⅰ和22．293ku的thaumatin Ⅱ。

thaumatin Ⅰ和thaumatin Ⅱ的区别仅在于5个保守氨基酸的变化。

L．Eddns等(1982)合成并测定thaumatin Ⅱ的cDNA序列，甜味蛋白翻译的起始产物是N端含有22个氨基酸残基，C端含有6个氨基酸残基的甜味蛋白质前体。在加工成熟过程中，这些氨基酸残基可被剪切掉而成为有活性的含207个氨基酸的甜味蛋白。

M．Witty(1990)认为在T．daniellii中这些被剪切掉的多肽含有定位甜味蛋白的信息。甜味蛋白等电点pH值为12，在生理环境中其中一些带电荷的极性氨基酸经化学修饰后进行功能分析，H Vander Wel(1994)认为它是引起甜觉的主要功能基因。

Kirm等(1994)对thaumatin Ⅰ的晶体结构分析表明包含3个结构域。其核心结构域为一夹在两个锁钥结构中的含11个片层的β折叠片结构。除N端片层和C端片层这两个折叠片互相平行外，其他β片层均为反平行。在β折叠片的一边存在两个β突起。

另两个结构域位于β片层的同一侧。一个结构域一端为环状，一端为cis构象脯氨酸残基的β带状结构，另一个结构域富含二硫键，从β折叠片层向外展开，它含1个α螺旋和3个短的螺旋片段。蛋白质定点突变结果分析显示这两个结构域是甜味受体的识别区域。甜味蛋白的这种富含二硫键的稳定结构可使其经高温煮沸1h后仍可复性成天然结构。

当甜味蛋白的浓度稀释到10^－8mol／L的阈值时，再也觉察不到甜味，J．D．igginbotham(1979，1981)研究表明，此时甜味蛋白可以起到选择性地增强其他物质的味觉强度的作用。如它可以使薄荷的感觉浓度阈值下降90%。

B．M．Menco等(1993)用5nm的金颗粒标记纯化的甜味蛋白蛋白质去观察甜味蛋白在猴子舌头上的分布。结果显示，金标记甜味蛋白只结合在味蕾小孔中的一种带电荷性质不明的似海绵状的分泌物质中。

味蕾中的微纤毛不含金标颗粒。

甜味蛋白的味觉受体复合物是包括甜味蛋白结合区域，未知分泌物和味蕾微纤毛的复合结构。

高等双子叶植物中都存在与甜味蛋白类似的蛋白质。P．Frendo等(1992)报道，非生物环境可以诱使玉米产生一种类似于甜味蛋白质的蛋白质，同源性可达50%～60%。

D．Robert等(1994)总结指出，多种植物中发现的甜味蛋白类似蛋白大都与渗透压紧张有关，其功能大致有3种：抗真菌活性，α－淀粉酶活性和蛋白酶活性。

基因工程

1．在原核系统中的表达。

L．Edens等(1982)分别在半乳糖启动子和色氨酸启动子下游克隆进甜味蛋白Ⅱ型的前体蛋白质的逆转录cDNA，在大肠杆菌中进行了低水平的表达。

每个细胞约500个分子。

但是分离出来的基因产物比预计的要大，可能是大肠杆菌不能完全加工甜味蛋白基因的起始转录前体，留下了N端信号肽序列，很可能C端多肽也没被剪切掉。可惜大肠杆菌的表达产物并不具备甜味蛋白所具有的甜味。C．Ilingworth等(1989)将甜味蛋白Ⅱ的cDNA克隆在2-淀粉酶引导肽的编码序列下游，在枯草杆菌中表达了α－淀粉酶－甜味蛋白的融合蛋白。表达产物在培养基中浓度可达1g／L，但也没有甜味。

2．在真菌系统中的表达。C．Ilingworth(1989)在S．lividans中表达了β－半乳糖苷酶引导肽－甜味蛋白融合蛋白。

Y．T．Hahm等(1990)成功地在曲霉中利用酵母中的3－磷酸甘油醛脱氢酶启动子表达了分泌性的甜味蛋白。但其产物均无甜味。

为了在酵母中表达出天然性状的甜味蛋白，J．H．Lee等(1988)根据thaumatin Ⅱ的cDNA序列合成了甜味蛋白基因，在合成基因中改用了酵母偏爱密码，并去除了氨基端和羧基端多肽编码序列，在5′端插入了甲硫氨酸密码子。此合成基因被置于3－磷酸甘油酸激酶启动子下游在S．cerevisiae中表达。

表达的重组甜味蛋白不能溶解，可占酵母不溶解蛋白的20%。由于当天然甜味蛋白二硫键数目减少时，其正常二级结构不能形成，会呈不溶性状，因此推测可能是由于二硫键结构不能正常形成才导致产生不溶的甜味蛋白。有意义的是，此不溶性的重组甜味蛋白质在体外经变性，再复性后会产生甜味。J．L．Weickmann等(1994)实现了甜味蛋白在酵母Saccharomycescerevisiae上的高效表达。其产物与天然甜味蛋白仍有很大差距。

3．在高等植物中的表达。

M．Witty(1990)应用毛根转化技术将甜味蛋白基因插入马铃薯基因组中。甜味蛋白Ⅱ先被克隆在植物穿梭载体pWINT2中的花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S下游，然后将此克隆载体与农杆菌Ti质粒一起接种在马铃薯愈伤组织中。待毛根组织形成后，可以分离培养出完整植株。此转基因毛根组织具有天然蛋白特有的甜味。

表达的甜味蛋白的浓度约为3×10^－8mol／L。并且整个植株都是甜的。

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【参考文献】：

1 Edens L,et al. Gene,1982.18(1):1～12

2 Witty M. Trends in biotechnology. 1990,8(5): 113～116

3 Vander Wel H. Thaumatin 1994,1994, (1):115 ～122

4 Kirm S-H,et al. Thaumatin 1994,1994, (1) :135～149

5 吕利群等．生物化学与生物物理学进展，1997，(24)1：36～38

(安徽大学张林维撰)