呼吸道病毒感染的快速诊断
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第1379页（5600字）
呼吸道感染是人类发病与死亡的主要原因之一，估计每年约有220万人死于急性呼吸道疾病，小儿占有很大比例，尤其是1岁以下儿童。
据统计，小儿最重要的死因是下呼吸道感染，而病毒感染在小儿下呼吸道感染中几乎占半数以上，主要的病原为腺病毒(Adv)、合胞病毒(RSV)、流感病毒和副流感病毒。为了更好地防治呼吸道病毒感染，国内外学者都十分重视快速诊断。所谓快速诊断，就是在短期内能确定其病原。
病毒快速诊断技术分两大类，一类是检测标本中的病毒抗原、病毒颗粒或病毒的核酸(DNA或RNA)，另一类是检测感染者特异性抗体。
检测标本中的病毒抗原或病毒颗粒包括直接电镜观察标本中的病毒颗粒和间接检测病毒抗原的存在。
免疫荧光技术 其原理是将免疫球蛋白与荧光色素以化学的方法结合而不损害免疫球蛋白的免疫活性，然后用此结合物染标本，与标本中的抗原特异性结合，荧光色素在激光的作用下发生荧光，通过荧光显微镜即可观察到，使不可见的特异性抗原抗体反应变为可见，显示抗原的存在。
即：未知抗原加荧光素标记的已知抗体→荧光素标记的抗原抗体复合物，可见到荧光。根据荧光标记抗体的不同，分为：(1)直接免疫荧光法：是将疑有病毒抗原的标本(鼻咽分泌物涂片、组织切片等)直接用荧光标记的特异性抗体染色。(2)间接免疫荧光法：是将荧光素标记在第2抗体上，将标记标本加已知的特异性抗体后，再加入荧光素标记的第2抗体染色。
(3)补体法：利用有些抗原抗体结合需补体参加的原理，将荧光素标记在抗补体抗体上，将已知抗体与待检抗原、补体一起孵育，然后加入荧光素标记的抗补体抗体。
此法比间接法还敏感，但有一定程度的非特异性荧光，且较少应用。
标本一般采用鼻咽分泌物脱落细胞，AdV荧光出现在胞核中，RSV、副流感病毒出现在胞浆中，流感病毒在胞核或胞浆内；呈弥漫染色。
如发现5个以上有特异性荧光的细胞则判为阳性标本。
直接免疫荧光法特异、简便、快速，但检测多种病毒抗原时需制备多种荧光抗体。间接法敏感性比直接法高5～10倍，应用一种荧光抗体可检测多种抗原，但比直接法需时较长且易出现非特异性荧光。已较普遍地应用于呼吸道病毒的快速诊断。
中国学者在70年代用直接法检测AdV，与传统法(指病毒分离和血清学)的阳性符合率为85．7%，80年代用间接法检测AdV和RSV，与传统法阳性符合率分别为88．6%和95．1%。免疫荧光技术的缺点为需较昂贵的荧光显微镜，并要去除非特异性荧光。
免疫酶技术 是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合起来的一种技术。通过化学方法将酶与抗原或抗体结合起来形成酶标记物，或者通过免疫学方法将酶与抗酶抗体结合起来形成免疫复合物，仍保持其免疫活性和酶的活性。然后与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的或含有酶的复合物。结合在免疫复合物上的酶遇到相应底物时，催化无色的底物或化合物生成可溶性的或不溶性的的有色产物。
如生成的产物为可溶性的，则用肉眼或分光光度计定性或定量测定结果；如生成的产物为不溶性的，同时又是电子致密物质，则可用光学显微镜或电子显微镜识别。因此，免疫酶技术是用酶作为标记物或指示剂进行抗原或抗体的追踪，是一项定位的和定量的综合性技术。
常用的酶有过氧化物酶和碱性磷酸酶。
免疫酶技术可分为两大类。一类用于检测生物组织或细胞中的抗原或其他成分，称为免疫酶染色法(免疫酶组化法)；另一类用于检测生物体液中的抗原、抗体或其他成分，称为免疫酶测定法。
免疫酶组化法。
此法包括3类：使用酶标记抗体的，称为酶标记抗体的，较常用，分为直接法和间接法；使用抗酶抗体的称为抗酶抗体法；使用酶标记抗体和抗酶抗体的称为放大抗体法。
因为细胞存在内源性过氧化物酶，所以如果使用辣根过氧化物酶作为标记物时，需去除内源酶，使用碱性磷酸酶则无此必要。
(1)直接法：是将辣根过氧化物酶直接标记在抗病毒抗体上，用此标记物染待检抗原片。底物用含有H2O2的二氨基联苯胺(DAB)，阳性细胞可见胞浆或胞核内有棕色的或棕褐色的颗粒，找到5个阳性细胞即可判为阳性标本。
1978年，Gardner等报道过用此技术检测咽分泌物中的流感A抗原和抗原RSV抗原，因在处理内源性过氧化物酶时，也破坏了病毒的抗原性而没有取得满意的结果。1980年中国学者经过反复试验，以0．228%过磺酸和0．001%硼氢化钠溶液浸泡咽脱落细胞各5分钟，即能消除内源酶的干扰又不影响病毒的抗原性。用本法检测AdV和RSV与传统法的总符合率分别为83．7%和87%，与传统法有明显的一致性。(2)间接法：将酶标记在第2抗体上，方法同间接荧光法。
判定结果同前。用此法检测AdV、RSV、流感病毒和副流感病毒与传统法的阳性符合率分别为93．2%、87．2%、97．5%和97．7%，且与传统法有明显的一致性。直接法特异、快速，间接法敏感和不需标记多种抗体，两法各有特点，可根据需要选用。(3)酶标记葡萄球菌蛋白A(SPA)法：又称A蛋白酶法，该方法是将酶标记在SPA上，再利用SPA能与多种动物IgG的Fc段非特异结合的特性，完成抗原的示踪或抗体的检测，简单、稳定，且不需标记多种抗体，一般情况下非特异性染色较轻，敏感性不亚于普通酶标记抗体法。
操作过程只要将间接法的酶标记抗体换成酶标记SPA即可。应用本法检测AdV和RSV，与传统法的总符合率分别为87．0%和87．4%，且与传统法有明显的一致性。(4)辣根过氧化物－抗辣根过氧化物酶(PAP)法：本法的关键是制备PAP试剂，一般为兔抗酶抗体－酶复合物。加样顺序为兔抗病毒抗体加羊抗兔IgG加兔抗酶－酶复合物加底物。本法检测RSV与传统法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为88．4%、88．8%和88．7%。本法操作简便，特异性染色易于辨认。缺点是比间接法又多一道程序，费时长。(5)碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)桥联酶标法：此技术80年代开始应用，主要是制备APAAP复合物，以此复合物作为第3抗体。
操作过程类似PAP法，底物为坚固红，并用甲基绿复染。检测RSV时阳性细胞胞浆呈鲜红色，胞核呈浅红色或无色，阴性标本细胞呈浅蓝色或无色，每份标本找到3个以上典型阳性细胞可判为阳性标本。该法检测RSV与免疫荧光检测的阳性符合率为97．2%。本法优点为可避免内源酶的干扰，因为碱性磷酸酶只存在于肠组织细胞内，2～3h即可出结果，阳性和阴性易于判断，缺点为此酶较昂贵，价格是过氧化物酶的10倍，且操作程序稍复杂。
(6)生物素－抗生物素(ABC)法：酶标记物是生物素－抗生素辣根过氧化物酶复合物(ABC)，其操作步骤同间接法，把酶标记第2抗体换为ABC。本法敏感，已应用于检测RSV。
酶联免疫吸附试验(ELISA)：是用固相载体作为免疫吸附剂，仍保持其免疫活性，方法很多，最常用的是间接法和双抗体夹心法。
ELISA检测病毒抗原，并用辣根过氧化物酶标记抗体，底物一般用邻苯二胺。
用抗病毒抗体包被，加待测标本，加抗病毒抗体，加酶标记第2抗体，加底物，最后加硫酸终止反应。
显色程度用分光光度计测定，一般OD值大于或等于阴性对照平均值的2～3倍为阳性。国外自1986年起用此法检测RSV，其特异性和敏感性与病毒分离及免疫荧光相比均在90%以上。ELISA容易自动化，标本处理简单，已成为常用的快诊方法之一。
放射免疫技术 用同位素标记抗体，应用放射免疫测定法进行检测，具有敏感性高，判定结果客观的优点，国外有人用于鼻咽分泌物RSV的检测。但本法需特殊仪器，且同位素对人体有害，限制了该法的使用范围。
单克隆抗体与免疫学技术相结合 中国学者采用免疫荧光、免疫酶技术在80年代获得的阳性检出率处于世界先进行列，但是由于使用常规抗体，不能做病毒型的诊断。单克隆抗体(McAb)较常规抗体更为特异，具有型特异性。现已制备出AdV、RSV、流感病毒和副流感病毒的McAb，取代上述方法中的常规抗体，用于可检测标本中的病毒抗原，可代替中和试验鉴定AdV的型别。
应用电子显微镜直接观察病毒颗粒 有人用电镜成功地找到鼻咽分泌物的副粘病毒颗粒，达到快诊目的，但比较困难，有发展前途的是用免疫电镜检查病毒。
目前只有少数单位具备开展此项技术的条件。
检测病毒的核酸：(1)核酸分子杂交技术是分子生物学的一项新技术，根据待测病原体某一DNA片段的序列制备一条寡核苷酸链做为探针，用同位素标记，在一定条件下与待检标本中相应病原体中的核酸单链据碱基互补原则杂交，经放射自显影而检出特异性核酸序列而明确诊断。
此技术较特异和敏感，但因使用同位素，应用受限。目前正在研究非同位素标记物。(2)多聚酶链反应(PCR)技术是近年发展起来的快速体外基因扩增技术。自1985年Saiki首选描述PCR以来，已在很短时间迅速进入医学各个领域，在检测病毒DNA或RAN方面其敏感性高于探针分子杂交。
其基本原理为根据待检病毒的DNA序列，合成一对寡核苷酸引物，提取标本中待检病毒的DNA做为模板，高温变性成为单链，低温退火与引物特异性相结合，在DNA多聚酶和四种碱基存在及中温条件下，以引物为起点，按碱基互补原则沿5′～3′方向延伸扩增出新的DNA拷贝，这样经变性、退火、延伸的循环，可将标本中极微量的病毒DNA扩增数百万倍，PCR产物可经凝胶电泳而检出。其特异性由引物的序列决定。
中国学者应用AdVDNA早期蛋白基因(E1)区域的引物检测了引起肺炎的AdV1E1基因，在几乎所有血清型的AdV都比较稳定，并且DNA序列基本一致，扩增的Soobp PCR产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上可显示出一条非常清楚的DNA带，在85份标本中有31份PCR阳性(36．5%)，有52份标本同时分离出病毒，并分离出20株AdV(38．5%)，而这52份标本中有24份PCR阳性(46．2%)。
PCR比病毒分离敏感快速，只要标本中有AdV，不论其有无感染性，均可用PCR检测到，而病毒分离只能检测到活病毒，PCR还特别适用于检测一些难培养的缺损病毒，如肠道AdV。
检测病毒抗体主要是测定血清中特异性IgM，因为IgM抗体的出现较早，消失较快，若IgM阳性可说明是新近感染。(1)应用已知抗原涂片+待检血清+荧光素标记抗人IgM(M链特异性)NIgG：此法需要去除过量的特异性IgG和类风湿因子。(2)直接ELISA－IgM法：抗人IgM的IgG包被+待检血清+酶标记抗原+底物。(3)IgG抗体捕获法：抗人IgM的lgM包被+待测血清+已知抗原+酶标记抗病毒抗体+底物。
本法操作简单、快速、敏感性高，有利于早期诊断。有研究资料表明，RSV特异性IgM在病后第1天即可测出，阳性反应全部出现在病后10天以内，与中和试验符合率达88．5%。
其他快速诊断方法有气相色谱技术，是使样品的气流通过一固定相，从而使其中各种不同组分得以分离的一种技术，然后用全相色谱检测仪检测。已有人应用裂解全相色谱法(PGC)诊断流感病毒，该法快速灵敏，可自动化。
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(白求恩医科大学一院儿科傅文永教授撰)