β－胡萝卜素

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第119页（8165字）

结构式

分子式：C₄₀H₅₆

相对分子质量：536．89

一、β－胡萝卜素的鉴别

1．试剂和溶液

1．1 三氯甲烷 分析纯。

1．2 环己烷 分析纯。

2．操作步骤

2．1 溶液的制备 精密称取0．05g样品，置于100mL棕色容量瓶中，加10mL三氯甲烷使之溶解，立即用环己烷稀释至刻度，摇匀。取5．0mL此液，置于100mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀得溶液A。

取5．0mL溶液A置于50mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀得溶液B。

2．2 测定 取溶液B在波长(455+1)nm和波长(483±1)nm处测定吸光度(A)，A_455／483的比值应为1．4～1．18。取溶液B在波长(455±1)nm处测定吸光度(A)；与溶液A在波长340±1nm处测定吸光度A的比值A₄₅₅×10／A₃₄₀应不低于15。

二、β－胡萝卜素的含量测定

1．原理

β－胡萝卜素是共轭双键的化合物，在波长(455±1)nm处有最大吸收，样品溶液于该波长处测定吸收度，以标准百分吸收系数()计算质量分数。

2．试剂和溶液

2．1 环己烷 分析纯。

2．2 样品溶液

溶液A：取0．05g样品，精密称定，置100mL棕色容量瓶中，加三氯甲烷10mL，先溶解，立即用环己烷稀释至刻度，摇匀。取5．0mL此液。置100mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

溶液B：取5．0mL溶液A，置于50mL棕色容量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀，即得。

3．仪器

3．1 紫外分光光度计。

3．2 石英比色杯(1cm)。

4．操作步骤

取溶液B用适宜的紫外分光光度计，在1cm石英比色杯中，测定在波长(455±1)nm处的吸收度(A)。以环己烷为空白对照。

5．分析结果的表述

式中 w——样品中β－胡萝卜素质量分数，%

A——样品溶液吸收度读数

m——样品的质量，g

V₁——样品稀释的总体积，mL

V₂——测定用吸取样品溶液体积，mL

2500——β－胡萝卜素标准品的百分吸收系数()

三、食品中β－胡萝卜素的测定

(一)第一法 高效液相色谱法

1．原理

样品中的β－胡萝卜素，用石油醚+丙酮(80+20)混合液提取，经三氧化铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

2．试剂和溶液

2．1 石油醚 沸程30～60℃，分析纯。

2．2 甲醇 分析纯，需重蒸。

2．3 丙酮 分析纯。

2．4 己烷 分析纯。

2．5 四氢呋喃 分析纯。

2．6 三氯甲烷 分析纯。

2．7 乙腈 色谱纯。

2．8 三氧化二铝 层析用，100～200目，140℃活化2h，取出放入干燥器备用。

2．9 含碘异辛烷溶液 精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25mL，摇匀备用。

2．10 α－胡萝卜素标准溶液 精确称取1mgα－胡萝卜素(Sigma公司生产)，加入少量三氯甲烷溶解，然后用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40μg／mL，放入－18℃储存备用。

2．11 β－胡萝卜素标准溶液 精确称取β－胡萝卜素12．5mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250μg／mL，－18℃储存备用，二个月内稳定。根据新需浓度取一定量的β－胡萝卜素标准液用移动相稀释成100μg／mL。

2．12 β－胡萝卜素标准使用液 分别吸取β－胡萝卜素标准溶液0．5mL，1．0mL，2．0mL，3．0mL，4．0mL，5．0mL于10mL容量瓶中，各加移动相至刻度，摇匀后，即得β－胡萝卜素标准系列，分别含β－胡萝卜素5μg／mL，10μg／mL，20μg／mL，30μg／mL，40μg／mL，50μg／mL。

2．13 β－胡萝卜素异构体 精确称取1．5mgβ－胡萝卜素于10mL容量瓶中，充入氮气，快速加入含碘异辛烷溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5min，然后在避光处用真空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烷溶解结晶，再用石油醚溶解并定容至刻度，浓度为150μg／mL，－18℃保存。

3．仪器

3．1 高效液相色谱仪。

3．2 离心机。

3．3 旋转蒸发仪。

4．测定方法

4．1 样品提取。

4．1．1 淀粉类食品：称取10．0g样品于25mL带塞量筒中(如果样品中β－胡萝卜素量少，取样量可以多些)，用石油醚或石油醚+丙酮(80+20)混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转入蒸发器中，重复提取直至提取液无色，合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为30℃)。

4．1．2 液体食品：吸取10．0mL样品于250mL分液漏斗中，加入石油醚+丙酮(80+20)20mL提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。合并提取液，在旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为30℃)。

4．1．3 油类食品：称取10．0g样品于25mL带塞量筒中，加入石油醚+丙酮(80+20)提取。反复提取，直至上层提取液无色，合并提取液，于旋转蒸发器蒸发至干。

4．2 纯化 将4．1．1、4．1．2、4．1．3的样品提取液残渣，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝柱层析。氧化铝柱为1．5cm(内径)×4cm(高)。先用洗脱液丙酮+石油醚(5+95)洗氧化铝柱，然后再加入溶解样品提取液的溶液，用丙酮+石油醚(5∶95)洗脱β－胡萝卜素，控制流速为20滴／min，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用0．45μm微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。

4．3 测定。

4．3．1 HPLC参考条件如下：

分析柱：大连化物所生产的spherisorbC18柱4．6×150mm

移动相：甲醇+乙腈(90+10)

流速：1．2mL／min

波长：448nm

4．3．2 样品测定：吸取4．2项下已纯化的溶液20μL，注入高效液相色谱仪，依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含β－胡萝卜素的量。

4．3．3 标准曲线：分别注射标准使用液各20μL，进行HPLC分析，以峰面积对β－胡萝卜素浓度画标准曲线或进行回归。

5．分析结果的表述

5．1 计算：

式中 x₁——样品中β－胡萝卜素的含量，g／kg或g／L

V₁——定容后的体积，mL

ρ₁——样品中β－胡萝卜素的量(在标准曲线上查得)，μg／mL

m₁——样品的质量，g(mL)

5．2 本方法检出限 仪器检出限0．1μg。方法检出限5．0mg／kg(L)。标准曲线范围为0～100mg／L，方法回收率为88．8%～99．0%。相对标准差为2．4%。

图5－4 α－、β－胡萝卜素色谱图

1—α－胡萝卜素 2－β－胡萝卜素

图5－5 α－、β－胡萝卜素异构体色谱图

1－α－胡萝卜素 2－β－胡萝卜素 3－β－胡萝卜素异构体

(二)第二法 纸层析法

1．原理

以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其它植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其它色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。

2．试剂和溶液

2．1 石油醚(沸程30～60℃) 同时是展开剂。

2．2 丙酮 分析纯。

2．3 丙酮－石油醚混合液 3+7(体积分数)。

2．4 无水硫酸钠 分析纯。

2．5 5%硫酸钠溶液。

2．6 1∶1氢氧化钾溶液 取50g氢氧化钾溶于50mL水。

2．7 无水乙醇 需经脱醛处理。

2．8 β－胡萝卜素标准溶液 取5mgβ－胡萝卜素标准品，溶于10mL三氯甲烷中，浓度为500μg／mL，准确测其浓度。

取标准溶液10．0μL，加3．00mL正己烷，混匀，测吸光度，比色杯厚度1cm，以正己烷为空白，波长为450nm，平行测定3份，取平均值。

2．9 分析结果的表述

式中 ρ——胡萝卜素标准溶液浓度，mg／mL

A——吸光度

E——β－胡萝卜素在正己烷中，波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为1μg／mL的吸光系数为0．2638

——将μg／mL换算成mg／mL

——测定过程中稀释的倍数

2．10 β－胡萝卜素标准使用液 将已标定的标准溶液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50μg，避光保存于冰箱中。

3．仪器

3．1 实验室常用设备。

3．2 玻璃层析缸。

3．3 分光光度计。

3．4 旋转蒸发器 具150mL球形瓶。

3．5 恒温水浴锅。

3．6 皂化回馏装置。

3．7 点样器或微量注射器。

3．8 新华滤纸 定性，快速或中速101号。

4．样品的采集和处理

4．1 粮食 样品用水洗3次，置60℃烘箱中烤干，磨粉，储于塑料瓶中，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。

4．2 蔬菜与其他植物性食物 取可食部分用水冲洗3次后，用纱布吸去水滴、切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存用。

5．测定方法(以下步骤需在避光条件下进行)

5．1 样品提取。

5．1．1 取适量样品，相当于原样1～5g(含胡萝卜素约20～80μg)的匀浆。粮食样品视其含胡萝卜素量而定，置100mL带塞锥瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min。将提取液转入盛有100mL5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10mL丙酮－石油醚混合液，振摇1min，将提取液并入分液漏斗中，如此提取2～3次，直至提取液无色为止。

5．1．2 植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(＜10g)，加脱醛乙醇30mL，再加10mL1∶1氢氧化钾溶液，回流加热30min。然后用冰水使之冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。

5．2 洗涤。

5．2．1 将提取液(5．1．1)静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15mL，直至下层水溶液清亮为止。

5．2．2 将皂化后样品提取液(5．1．2)用水洗涤至中性。

5．2．3 将5．2．1或5．2．2的石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的着色剂，洗涤液并入球形瓶内。

5．3 浓缩与定容 将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为30℃，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2．0mL石油醚定容，备层析用。

5．4 纸层析。

5．4．1 点样：在18cm×30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点(见图5－6)，吸取0．10～0．40mL浓缩液(5．3)在AB和CD间迅速点样。

图5－6 点样示意图

5．4．2 展开：待纸上所点样自然挥干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。

5．4．3 洗脱：待胡萝卜素与其他色素分开后，取出滤纸，自然挥干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜层析带剪下，立即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入溶剂中。

5．5 比色测定 用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于波长450nm下，以其值从标准曲线上查出β－胡萝卜素的含量，供计算时用。

5．6 标准曲线绘制 取β－胡萝卜素标准使用液(浓度为50μg／mL)1．0mL，2．0mL，3．0mL，4．0mL，6．0mL，8．0mL分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0．100mL，标准曲线各点β－胡萝卜素含量为2．5μg，5．0μg，7．5μg，10．0μg，15．0μg，20．0μg。为测定低含量样品，可在0～2．5μg间加几点，以β－胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线(见图5－10)。

6．分析结果的表述

式中 x₃——样品中β－胡萝卜素的含量，以β－胡萝卜素计，mg／100g

m₁——在标准曲线上查得的胡萝卜素的含量，μg

V₁——点样体积，mL

V₂——样品石油醚提取液浓缩后的定容体积，mL

m——样品质量，g

7．允许差

同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值＜10%。

图5－7 胡萝卜素标准曲线图