维生素A的测定方法

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第230页（6569字）

化学名：反式－3，7－二甲基－9－(2，6，6－三甲基－1－环己烯基－1)－2，4，6，8－壬四稀乙酸酯〔trans－3，7－dimethyl－9－(2，6，6－trimethyl－1－cyclohexen－l－yl)－2，4，6，8－nonatetzaene－1－acetate〕

别名：视黄醇

结构式：

分子式：C₂₂H₃₂O₂

相对分子质量：328．49

一、维生素A的鉴别

1．试剂和溶液

1．1 三氯甲烷；异丙醇。

1．2 三氯化锑溶液 取三氯化锑适量，制成250g／L的三氯甲烷溶液。

2．操作步骤

2．1 取本品的三氯甲烷溶液(1mL含维生素3μg)1mL，加三氯化锑饱和溶液5mL，溶液呈蓝该颜色随即消失。

2．2 维生素A异丙醇溶液在波长324～328nm内有最大吸收峰。

二、维生素A含量测定

1．试剂和溶液

环己烷。

2．仪器

紫外分光光度计。

3．测定方法

取本品适量，精密称定，加环己烷溶解并定量稀释成3～5μg／mL的溶液，按照维生素A测定法(《中华人民共和国药典》1990年版二部附录第66页)测定其吸收峰的波长，并在表9－7所列各波长处测定吸收度。计算各吸收度与波长328nm处的吸收度的比值和波长328nm处的。

测定应在半暗室中快速进行。

表9－7

4．分析结果的表述

如果吸收峰波长在326～329nm之间，且所测得各波长吸收度比值不超过表(9－7)中规定值的±0．02，可用式(9－36)计算含量：

式中 x——每克样品中含有维生素A的单位——百分吸收系数

如果吸收峰波长在326～329nm之间，但所测得的各波长吸收度比值超过表9－6中规定值的±0．02，应按式(9－37)求出校正后的吸收度，然后再计算含量。

A₃₂₈(校正)=3．52(2A₃₂₈－A₃₁₆－A₃₄₀) (9－37)

式中 A₃₂₈(校正)——在波长328nm处校正后的吸收度

A₃₂₈——在波长328nm处的吸收度

A₃₁₆——在波长316nm处的吸收度

A₃₄₀——在波长340nm处的吸收度

如果校正吸收度与未校正吸收度相差不超过±3．0%，则不用校正吸收度，仍以未经校正的吸收度计算含量。

如果校正吸收度与未校正吸收度相差在－15%～－3%之间，则以校正吸收度计算含量。

如果校正吸收度超过未校正吸收度的－15%或+3%，或者吸收峰波长不在326～329nm之间，则样品须按照《中华人民共和国药典》1990年版二部附录第66页维生素A测定法项下第二法测定。

5．允许差

本方法两次平行测定的允许相对差在3%以内。

三、食品中维生素A的测定

(一)紫外分光光度法

1．原理

维生素A为脂溶性维生素。先将样品中脂肪抽提出来，经皂化，萃取不皂化部分，再经柱层析，除去杂质，利用维生素A在紫外325nm的最大吸收特性测定。

2．试剂和溶液

2．1 乙醚 分析纯，不含过氧化物。

2．2 石油醚 30～60℃石油醚，重蒸。

2．3 无水硫酸钠 分析纯。

2．4 洗脱液 乙醚在石油醚中浓度(体积分数)分别为4%、8%、12%、16%、20%、24%、30%、35%、40%、45%和50%。

2．5 800g氢氧化钾 氢氧化钾(分析纯)400g溶于水，至500mL。

2．6 维生素A油剂。

2．7 无水乙醇 分析纯。不含醛类。

2．8 焦性没食子酸 分析纯，粉状。

2．9 氨水 分析纯，含氨25%～28%。

2．10 25%三氯化锑氯仿液 分析纯。25g三氯化锑溶于100mL氯仿，贮于棕色瓶中。

2．11 碱性氧化铝(层析用，100～200目) 碱性氧化铝在120℃烘箱烘4h后，称取100g加4mL蒸馏水于150mL试剂瓶中，用力振荡使无块状，瓶口封紧，贮入干燥器，16h后使用。

2．12 中性氧化铝(层析用，100～200目) 中性氧化铝于550℃高温炉中活化5．5h，降温至300℃左右(约1．5h)，取出装瓶，冷后每100g加4mL蒸馏水于150mL试剂瓶中，用力振荡使无块状，瓶口封紧，贮入干燥器，16h后使用。

3．仪器

3．1 层析柱 2cm×30cm，具活塞，有砂芯玻璃板。

3．2 紫外分光光度计。

4．测定方法

整个步骤应避免阳光直射，层析时，须在暗室。

4．1 抽提皂化 准确称取10±0．1g(约含维生素A200～300IU)样品于烧杯中，加40mL水搅匀，移入250mL分液漏斗中，分别加氨水5mL、乙醇35mL，摇匀，用乙醚3×40mL振摇抽提，乙醚层用3×100mL水洗涤，水层用30mL乙醚再抽提一次，合并乙醚层，在氮气流下，于40℃以下减压蒸干，加30mL800g／L氢氧化钾、40mL乙醇、0．8g焦性没食子酸，在83±1℃水浴中皂化30min。

4．2 水洗蒸干 冷却后，移入250mL分液漏斗中，加60mL水，用30×40mL乙醚抽提，合并醚层，用水洗至中性按4．1中方法蒸干后溶于5mL石油醚，移入刻度试管。

4．3 层析 依次装8cm高中性氧化铝、3cm高碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠于层析柱内，以石油醚浸透(湿法装柱)，将4．2所得5mL石油醚样品液缓缓入柱，以2×1mL石油醚洗试管后并入柱内，石油醚流速为30～40滴／min，当液面下降至接近无水硫酸钠表面时，加5mL石油醚，随后再逐次加5mL4%、8%、……45%洗脱液，最后用50%洗脱液洗脱，层析柱上第一个黄色层析带一般是β－胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗出，收集于10mL容量瓶中，至流出之洗脱液无黄色为止(此液可供测定β－胡萝卜素)。

维生素A一般在50%洗脱液前后洗出，用2mL刻度试管，每管准确收集1mL，吸约0．2mL于微型烧杯中，加约0．3mL25%三氯化锑氯仿溶液，如呈蓝色，表明有维生素A，分别从有维生素A的各管精确吸0．5mL于10mL容量瓶中，以石油醚定容。

4．4 测定 维生素A在323～326nm有一最大吸收峰，在石油醚中其比吸光度为1830，用紫外分光光度计，以石油醚为空白，1cm石英比色皿，在波长325nm测吸光度。

5．分析结果的表述

式中 E——吸光度

m——样品质量，g

每0．3μg维生素A为1IU。

(二)三氯化锑比色法

1．原理

维生素A在氯仿溶液中能与三氯化锑形成蓝色物质。此蓝色溶液在620nm处有一最大吸收光谱，且蓝色深浅与维生素A的含量成正比，此蓝色物质虽然不甚稳定，能很快褪色或变成其他颜色，但仍可在一定时间内(6s内)，用分光光度计比色测定。

2．试剂和溶液

2．1 乙醚 蒸馏乙醚，弃去初馏液和残留液各10%，在1cm比色杯中，以重蒸水为参比测定吸光度，在波长300～350nm处吸光度应为零，不应含有过氧化物。

过氧化物检查方法：在有5mL乙醚的试管中，加入50%碘化钾溶液1mL，振摇0．5min，观察水层，如呈黄色，即表示有过氧化氢存在。

2．2 乙醇 应不含醛类物质。检查方法：取少量乙醇，加入银氨溶液加热，若有银镜反应发生，表示样品中有醛。

脱醛处理：取乙醇1～2L，加硝酸银2g(先溶于少量水中)，振摇，再加氢氧化钠4g(先溶于温乙醇中再倒入)，振摇过夜，将层清液倾入蒸馏瓶中蒸馏，弃初馏液10%。

2．3 50%氢化钾溶液。

2．4 无水硫酸钠。

2．5 氯仿 将氯仿置分液漏斗中，用蒸馏水洗涤数次后，将氯仿层取出蒸馏，然后用无水硫酸钠脱水即成。

2．6 三氯化锑溶液 20g三氯化锑及2mL无水乙酸，加氯仿溶解成100mL。

2．7 石油醚 沸程30～60℃。

2．8 95%乙醇。

2．9 浓氨水。

2．10 0．5mol／LKOH溶液。

2．11 醋酸酐。

2．12 维生素A标准溶液 1000IU／mL贮备液：取醋酸维生素A(1g=1000000IU)0．1g，用氯仿溶解，移于100mL容量瓶中，用氯仿定容。

100IU／mL中间液：精确吸取贮备液10mL于100mL容量瓶中，用氯仿定容。临用时配制。

10IU／mL工作液：精确吸取中间液10mL于100mL容量瓶中，用氯仿定容。临用时配制。

3．测定方法

3．1 样品处理 称取适量经组织捣碎或搅匀的样品，置小烧杯中，加水至10mL，再加氢氧化铵10mL，用玻璃棒搅成匀乳状，倒入100mL具塞量筒中(若为液体样品可直接吸取10mL于量筒中，加氢氧化铵1．25mL，以下步骤按鲜乳中有关脂肪测定方法处理)，用10mL乙醇分数次洗入烧杯中，洗液并入量筒中，加塞振摇。再以2．5mL乙醚洗涤烧杯，并入量筒中。加塞振荡1min。静置约0．5h，待分层清晰后，分出脂肪醚层，供测定用。操做应迅速、避光。

3．2 皂化 取适量的提取醚层于蒸馏瓶中，置70℃水浴上蒸发醚层至4～5mL，加入数粒玻璃珠，加入50%氢氧化钾溶液30mL、无水乙醇40mL，在水浴上回流0．5～1h，至皂化完全，加入10mL水，振摇，皂化液澄清透明，不混浊，即表示皂化完全。

3．3 提取 将皂化瓶内溶液移入500mL分液漏斗中，用40～60mL温水(30～40℃)洗皂化瓶，洗液亦并入分液漏斗中，加入50mL乙醚振摇抽提，静置分层，如有少量乳化现象，可加入少量无水乙醇除去。醚层移入另一分液漏斗，水层继续以50mL石油醚、50mL乙醚、40mL石油醚、40mL乙醚分次振摇提取，合并醚层，然后分别用水、0．5mol／LKOH溶液反复洗至中性，弃水层，醚层过无水硫酸钠，用乙醚洗分液漏斗，漏液在三角烧瓶中于水浴上回收乙醚至5mL左右，减压至恰干，迅速加入5mL氯仿，用少量氯仿洗三角烧瓶，并用氯仿定容至10mL。

4．测定

4．1 标准曲线的绘制 精确吸取维生素A标准中间液或工作液(视样品中维生素含量高低而定)1．0mL，2．0mL，3．0mL，4．0mL，5．0mL，分别置10mL量瓶中，用氯仿定容。分别吸取上述标准液1mL，以试剂为空白，加入醋酸酐1滴，同4．2测吸光度，绘制标准曲线。

4．2 样品测定 以1mL氯仿加3mL三氯化锑氯仿液作空白，用1cm杯，于波长620nm处测样品液吸光度。先将1mL样品液加3mL三氯化锑氯仿液迅速搅匀，倒入比色皿，立即读取最大吸光度，从标准曲线上查得维生素A含量。

5．分析结果的表述

式中 ρ——从标准曲线上查得维生素A的浓度，IU／mL

V₁——用氯仿定容的量，mL

V₂——样品测定时所取样液的量

m——样品质量，g