烟酸的测定方法
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第275页（13494字）
化学名：氮苯酸－3；吡啶酸－3(nicotinic acid)。又名维生素pp，尼克酸
结构式：
分子式：C6H5NO2
相对分子质量：123．11
一、烟酸的鉴别
1．试剂和溶液
1．1 2，4－二硝基氯苯。
1．2 0．4%氢氧化钠溶液。
1．3 硫酸铜。
1．4 氢氧化钾。
2．操作步骤
2．1 取本品约4mg，加2，4－二硝基氯苯8mg，研匀，置试管中，缓缓加热熔化后，再加热数秒钟，放冷，加乙醇氢氧化钾试液3mL，即显紫红色。
2．2 取本品约50mg，加水20mL溶解后，滴加0．4%氢氧化钠溶液至遇石蕊试纸显中性反应，加硫酸铜试液3mL，即缓缓析出淡蓝色的沉淀。
2．3 取本品，加水制成每1mL中含20μg的溶液，照分光光度法测定，在波长262nm处有最大吸收峰，在波长237nm处有最小吸收；吸光度237nm与吸光度262nm的比值应为0．35～0．39。
二、烟酸含量的测定
取本品约0．3g，精密称定，加新沸过的冷水50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用0．1mol／LNaOH滴定液滴定。每1mL0．1mol／LNaOH滴定液相当于12．31mgC6H5NO2。
(一)高压液相色谱法
1．试剂和溶液
1．1 95%乙醇 特级。
1．2 60%高氯酸 特级。
1．3 高氯酸－甲醇溶液 向95mL0．003mol／L HClO4中加入5mL甲醇溶液。
1．4 0．003mol／LHClO4溶液 0．5mL高氯酸，加水成1000mL。
1．5 无水硫酸钠 特级。
1．6 甲醇 色谱纯。
2．仪器
高压液相色谱仪。
3．测定方法
3．1 样品溶液的制备 称取1～5g相当0．1～0．5mg烟酸的样品，放入50mL离心管中，加30mL乙醇混合，然后在超声波发生器中时时振摇，萃取15min后离心分离(10min， 3000r／min)。上清液倒入事先装有约10g无水硫酸钠的层析柱中，用200mL圆底烧瓶接收流出液。每次用30mL乙醇反复洗残渣及层析柱。然后在60℃水浴中减压浓缩，除去乙醇，再加入10mL高氯酸－甲醇溶液，然后放入超声波发生器中30s。溶解液移入50mL容量瓶中，残渣用上述方法反复处理，将全部溶解液合并，用10mL高氯酸－甲醇溶液稀释至刻度。过0．45μm膜，作为样品溶液。
3．2 标准液的制备 准确称量烟酸10mg，加水溶解成100mL，作为标准液(1mL相当于烟碱酸100μg)。分别吸取此液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，用高氯酸－甲醇溶液稀释至50mL，作为标准曲线用工作液(1mL分别相当于烟酸2μg、4μg、6μg、8μg、19μg)。
3．3 测定。
3．3．1 测定条件：高压液相色谱测定条件。
填充剂：化学结合型硅胶；
色谱柱：内径4．6mm，长15cm；
柱温：50℃；
洗脱液：高氯酸－甲醇溶液；
流速：1．0mL／min；
鉴定器：紫外，波长261nm。
3．3．2 标准曲线：分别取标准曲线用工作液10μL，注入高压液相色谱中，根据峰高绘制标准曲线。
4．分析结果的表述
取10μL样品溶液，注入高压液相色谱中，根据所得峰高在标准曲线上求出样品溶液中烟酸浓度，按式(9－65)计算样品中含量(mg／100g)。
式中 ρ——样品溶液中烟酸浓度，μg／mL
m——取样量，g
(二)比色法
1．原理
烟酸在食物中常与其他化合物结合。样品经酸水解后，烟酸成游离态，利用它与溴化氰作用后可与对氨基苯磺酸产生黄色化合物，在一定条件下，颜色深浅与食物中烟酸含量成正比，可在波长440nm处，测其消光度与标准液比较。
2．试剂和溶液
2．1 标准烟酸溶液。
2．1．1 贮备液(100μg／mL)：精确称取标准烟酸5．0mg(预先在有五氧化二磷的干燥器中过夜，暗室内贮藏)，溶于25%乙醇溶液中，移入500mL容量瓶，并用25%乙醇溶液定容，贮存在10℃处。
2．1．2 中间液(10μg／mL)：取部分贮备液，回至室温后吸10mL，用水定容至100mL。
2．1．3 工作液(4μg／mL)：吸2mL贮备液，用水定容至50mL。
2．2 氨水 取5mL浓氨水，用水稀释至250mL。
2．3 盐酸(1→5)。
2．4 磷酸缓冲液pH8 溶解60g磷酸氢二钠，10g磷酸二氢钾于温水，稀释至200ml。
2．5 10%的溴化氰液 加热370mL水至40℃，加40g溴化氰结晶，摇匀，至溶解，冷却后稀释至400mL(在毒气柜中操作，注意其毒性)，贮冰箱内。
2．6 10%对氨基苯磺酸 在170mL水中，加入20g对氨基苯磺酸，同时加氨水溶解，每次1mL，直至全部溶解，用1：1盐酸调节pH至4．5，以溴甲酚绿为外指示剂。
2．7 溴甲酚绿指示剂 称取0．1g溴甲酚绿，在研钵中研细，加2．8mL0．05mol／LNaOH溶液溶解，以水稀释至200mL，pH4时为绿色，pH5．8时为蓝色。
2．8 55%对氨基苯磺酸 加27mL水和27mL氨水于55g氨基苯磺酸，冷溶解，若不溶，可加热调节pH为7(用数滴氨水或5mol／L HCl溶液)稀释至100mL，贮于避光处。
2．9 1mol／L(1／2H2SO4)。
2．10 硫酸铵 分析纯。
3．仪器
分光光度计或比色计。
4．测定方法
4．1 以乳为主的婴儿食品。
4．1．1 抽提。
4．1．1．1 准确称取15～20g(要求在比色时抽提液中含烟酸3～4μg／mL)于1000mL三角瓶中，加200mL1mol／L(
H2SO4)混匀。98kPa压力下，加热30min，冷却后用10mol／L〔
Ca(OH)2〕调节pH至4．5(用溴甲酚绿为外指示剂)，加水稀释定容至250mL，过滤，备用。
4．1．1．2 称取17g硫酸铵于50mL容量瓶内，准确加入上述过滤样液40mL，加水定容，猛烈摇匀，过滤，备用(测定样液)。
4．1．1．3 吸取工作液40mL于内有17g硫酸铵的50mL容量瓶，用水稀释定容，过滤，此标准含烟酸3．2μg／mL。
4．1．2 测定：按下列顺序分别加入溶液。
(1)标准液对照
1．0mL标准液
5．0mL水
0．5mL稀氨水(2．2)
2．0mL10%对氨基苯磺酸
0．5mL稀盐酸(2．3)
(2)标准液
1．0mL标准液
0．5mL稀氨水(2．2)
5．0mL溴化氰
2．0mL10%对氨基苯磺酸
0．5mL水
(3)样品对照液
1．0mL样品液
5．0mL水
0．5mL稀氨水(2．2)
2．0mL10%对氨基苯磺酸
0．5mL稀盐酸(2．3)
(4)样品液
1．0mL样品液
0．5mL稀氨水(2．2)
5．0mL溴化氰
2．0mL10%对氨基苯磺酸
0．5mL水
测定每一样品时应同时作一对照管，加试剂时应按次序一管加完比色后再加第二管，每加完一种试剂均应旋转试管、摇匀，溴化氰加完0．5min后再对加氨基苯磺酸，摇匀，塞好塞子。
4．1．3 比色：440nm，1cm杯。蒸馏水调零及满量程、测定标准液对照、标准液、样品液对照及样品液的吸光度，应反复测定多次，选择最大值，一般测定标准液及样品液的消光值最大值，费时较长。
溴化氰有剧毒，操作应在毒气柜中进行。
4．2 谷类婴儿食品。
4．2．1 步骤如下： 绘制标准曲线：准确吸取标准中间液(10μg／mL烟酸)0．0，5mL，10mL，15mL，20mL和25mL于6只250mL三角瓶内，三角瓶先加入1．5g氢氧化钙。然后每瓶均加水至90mL，在9．8kPa压力下水解2h。取出，冷却后，加水定容至100mL，放冰箱中过夜。
自每一量瓶吸取上清液50mL左右，移入离心管，再放冰浴15min或冰箱2h，取出离心15min，从每一离心管吸取上层清液20mL移入放有8g硫酸铵及2mL磷酸缓冲液的离心管中，摇匀，溶解，加热至55～60℃离心5min，过滤，若滤液不清，再过滤备用。
分别吸取上述不同浓度的标准抽提液各5mL，一式两份，移入甲、乙二组试管中，甲组作为标准液对照管，各加10mL水，所有管均置冰浴中30min，逐个取出进行测定；乙组标准液试管内分别加入10mL冷溴化氢液，摇匀，30s时再加1mL55%对氨基苯磺酸摇匀，再置冰浴数分钟，取出于波长470nm测定吸光度(以试剂空白校正管调零)，标准液对照管则只需各加1mL55%氨基苯磺酸即可测定其吸光度。
以不同浓度的标准液的吸光度为纵坐标，以相应的烟酸微克数为横坐标绘制标准曲线。
4．2．2 样品测定：准确称取样品2．5～5g(约含100mg烟酸)于250mL三角瓶，瓶内预先加入1．5g氢氧化钙，加水90mL，在100kPa压力下水解2h，取出趁热摇匀，冷却后加水定容至100mL，放冰箱过夜，以下按4．2．1自“自每一量瓶中吸取上清液50mL……测定吸光度”依法操作，绘制标准曲线。样液测定与作标准曲线同时进行。
5．分析结果的表述
5．1 以乳为主的婴儿食品：
式中 ρ——所加标准溶液浓度，μg／mL
E0——样品液对照管的吸光度
E——样品液管的吸光度
——标准液对照管的吸光度
Es——标准液管的吸光度
m——样品质量，g
5．2 各类婴儿食品。
式中 m——样品质量，g
c——根据样液吸光度，从标准曲线上查出的烟酸微克数
三、肉与肉制品中维生素pp含量测定
1．原理
维生素pp经氢氧化钙溶液提取，与溴化氰结合，在对氨基苯乙酮作用下，生成黄色化合物，在波长420nm处有最大吸收。其吸光度与维生素pp浓度成正比，以此测定维生素pp含量。
2．试剂和溶液
2．1 维生素pp(尼克酸或尼克酰胺)标准溶液 1mg／mL。
精确称取维生素pp100mg，用5mol／L(1／2H2SO4)1mL溶解，转移到100mL容量瓶中，用水定容。在4℃冰箱内保存。
2．2 硫酸锌 饱和溶液。
2．3 溴化氰〔注〕 10%溶液。
2．4 对氨基苯乙酮 2%溶液。称取对氨基苯乙酮2g，用少量盐酸溶解，稀释至100ml。
2．5 氢氧化钙 1mol／L溶液。
2．6 氢氧化钠(GB629) 3mol／L、1mol／L溶液。
2．7 盐酸(GB622) 6mol／L溶液。
2．8 酚酞指示剂 1%乙醇溶液。
2．9 硫酸(GB625) 5mol／L、1mol／L溶液。
2．10 乙醇(GB679)。
2．11 戊醇。
注：溴化氰是剧毒试剂，应戴上手套在通风橱里配制。
3．仪器设备
3．1 实验室常规设备。
3．2 恒温水浴。
3．3 分光光度计。
3．4 绞肉机 孔径不超过4mm。
4．操作步骤
4．1 试样 取具有代表性试样200g，于绞肉机中至少绞2次，并使其混匀，在密闭容器中于4℃下贮存备用。
4．2 提取 称取试样2g(精确到0．001g)于三角瓶中，加1mol／LCaOH溶液10mL，水40mL，混匀后，在沸水浴上提取90min，冷却后移入100mL容量瓶中，定容。混匀过滤，滤液备用。
4．3 中和 吸取滤液25．00mI于50mL容量瓶中，加酚酞指示剂2滴，用6tool／L HCl
溶液中和至红色刚刚褪去。加入饱和硫酸锌溶液2mL及几滴戊醇(清泡剂)，用3mol／L和
1mol／L NaOH溶液调至粉红色。滴加1tool／L(1／2HzSO4)溶液。使粉红色刚好褪去，水定容，
混匀，放置10min后过滤，滤液备用。
4．4 测定。
4．4．1 标准曲线的绘制：吸取维生素pp标准液0．25mL。，0．50mL，1．00mL，
2．00mL，2．50mL．分别于100mL．容量瓶中并定容，摇匀。浓度分别为2．5ug／mL，5．0ug／mL，
10．0ug／mL，20．0ug／mL，25．Oug／mL。 ．
分别吸取上述稀释液1．00mL于具塞试管中，加水4mL，10％溴化氰溶液2m1．摇匀。置
60～70~C水浴中保温15min后，迅速冷却。加入2％对氨基苯乙酮溶液1mL，摇匀，在暗处放
置15min。在波长420nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，维生素pp为横坐标绘制标准曲
线。
4．4．2 试样溶液的测定：吸取试样液5．00m1．于具塞试管中，加入10％溴化氰溶液
2mI。混匀。以下操作按4．4．1步骤进行。
5．分析结果的表述
式中 x——样品中维生素pp含量，mg／100g
m1——从标准曲线上查得维生素pp质量，μg
m0——试样质量，g
40——试样溶液的稀释倍数
当符合允许差所规定的要求时，取两次测定结果的算术平均值作为结果，精确到0．01μg／100g。
6．允许差
同一分析者同时或相继两次测定结果之差不得超过平均值的10%。
四、微生物法
1．原理
烟酸广泛存在于食物中，并常与其他化合物结合，在动物组织内又常以烟酰胺形式存在，烟酰胺为辅酶Ⅰ与辅酶Ⅱ的组成部分，此烟酰胺乃是一种生物活动形式。测定前，样品先经过酸、碱处理，游离出烟酸。利用阿拉伯乳酸杆菌对烟酰胺具有相等活性，用标准液对照测定。
2．试剂和溶液
2．1 菌种 阿拉伯乳酸杆菌。
2．2 不含维生素的酪蛋白 称取250g酪蛋白，放于5L容器中，慢慢加入3．6L水以防结块，加1mol／LHCl2．77mL，搅拌3min，用虹吸法除去上层清液，再加入3．6L水，1mol／LHCl2．77mL，如此反复3次后，再加入3．6L水，1．2mol／L氨水55．5mL，过夜，使酪蛋白溶解成浆状，用布过滤，滤液用1mol／LHCl调至pH4．5，使酪蛋白全部沉淀，过滤，除去水，用50～60℃热水冲洗沉淀几次，挤压去水，放烘箱烘干。
2．3 酸解酪蛋白 称50g不含维生素的酪蛋白，加200mL3mol／LHCl于98kPa压力下水解6h，水解物盛于蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状，加水溶解再蒸发，反复3次，以除去HCl(不可蒸干或焦糊)，用氢氧化钠溶液调节pH至3．5，以溴酚蓝作外指示剂(pH2．6～4．6黄～蓝，pH3．5为紫色)，加20g活性炭吸附至水解液为无色或略呈淡黄色，过滤，加水至500mL，加甲苯少许保存。
活性炭在pH3．5时，可吸附酪蛋白中的烟酸，脱色力也较强。
2．4 胱氨酸、色氨酸溶液 称4gL－胱氨酸、1gL－色氨酸(或2gDL－色氨酸)于800mL水中，加热至70～80℃，滴加20%盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止(约12mL)，冷至室温，加水至1000mL。
2．5 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 称硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤及尿嘧啶各0．1g于250mL烧瓶中，加75mL水及2mL浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却。若有沉淀发生，加浓盐酸数滴，再加热，如此重复，直至冷却无沉淀发生为止，移入100mL容量瓶，用水定容。
2．6 混合液 D－泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg，置1000mL容量瓶中，用水定容，保存于棕色瓶中。
2．7 核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液 溶解1mg生物素结晶(无酸者)于100mL0．02mol／LCH3COOH溶液中，取此液4mL(相当于40μg)于1000mL容量瓶中，加入20mg核黄素、10mg盐酸硫胺素，以0．02mol／LCH3COOH溶液定容，保存于棕色瓶中。
2．8 甲盐溶液 溶25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾于水中，加水至500mL，加少许甲苯保存。
2．9 乙盐溶液 10g硫酸镁(MgSO4·7H2O)，0．5g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，0．5g硫酸锰(MnSO4·4H2O)溶于水，至500mL，加5滴盐酸，少许甲苯保存。
2．10 烟酸标准溶液。
2．10．1 贮备液：精确称取标准无水结晶烟酸50mg(在P2O5干燥器中过夜)，以25%乙醇稀释，并定容至500mL(0．1mg／mL)，加少许甲苯，保存于冰箱。
2．10．2 工作液：取贮备液1mL，用水稀释定容为1000mL(0．1μg／mL)，用时现配。
2．11 基本培养贮备液。
水解酪蛋白 50mL
胱氨酸，色氨酸液 50mL
腺嘌呤，鸟嘌呤，尿嘧啶液 10mL
D－泛酸钙、对氨基苯甲酸，吡哆醇液 10mL
核黄素，盐酸硫胺素，生物素液 10mL
甲盐液 10mL
乙盐液 10mL
无水葡萄糖 10g
无水乙酸钠 10g
上列物质混合于1000mL容量瓶内，加水450mL，用浓氢氧化钠液调节pH至6．8，加水定容。
2．12 琼脂培养基。
乙酸钠(NaAc·3H2O) 1．7g
无水硫酸钠 1g
蛋白 0．8g
酵母提取物的干粉 0．2g
甲盐溶液 0．2mL
乙盐溶液 0．mL
琼脂 1．2g
称以上物质，加水至100mL，于水浴上加热至琼脂溶化，趁热调节pH至6．8，倒入试管，每管3～5mL，塞棉塞，灭菌(100kPa，10min)，冷后存冰箱备用。
2．13 贮备菌种的制备 以Iact、A纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中；于(37±5)℃保温箱中16～24h；贮于冰箱至多不超过2星期，最好每星期移种一次，保存数星期以上的菌种，不能立即作制备菌种用，一定要在使用前每天移种一次，连续2～3天方可使用。
2．14 种子培养液 取基本培养基(2．11)5mL，加0．2μg／mL烟酸标准液5mL，装入15mL离心管中，塞棉塞，消毒(100kPa，10min)后，贮于冰箱备用(可贮放数星期)。
2．15 生理盐水 称9g氯化钠溶于1000mL水中，用时取出部分，在100kPa压力下，消毒10min。
2．16 0．04%溴麝香草酚蓝指示剂 称0．1g麝香草酚蓝于研钵中，加1．6mL0．1mol／LNaOH溶液，研磨，加水少许，至完全溶解，加水至250mL。
2．17 1mol／L(
H2S04)。
3．仪器设备
3．1 保温箱 37℃。
3．2 混浊度计或比色计。
3．3 压力锅(100kPa以上)。
3．4 离心机 3000r／min。
3．5 培养皿。
4．操作步骤
4．1 接种液的制备 使用前一天，将Iact、A菌种由贮备种管移种于已消毒的种子培养液中，同时制备两管，于37℃保温16～24h，不能超过24h。如不能按时接种，可将接种液取出放冰箱，24h可用。
于3000r／min离心10min，倾去上清液，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10mL生理盐水，摇动，使菌种成混量体。
将此液吸入已消毒的注射器内，立即应用。
4．2 样品的制备 称取含烟酸0．2mg的样品，置于250mL烧瓶中，加1mol／L(1／2H2SO4)100mL，混合均匀，在100kPa压力下，加热30min。1mol／L(1／2H2SO4)水解足可使烟酸和其它物质结合链分开而游离出。
冷至室温，用氢氧化钠溶液调节pH至6．8，稀释到50mL，过滤，即可作分析用。
4．3 标准管的制备 在三组试管中，每管各加0．1μg／mL标准烟酸工作液：0．0，0．5mL，1．0mL，1．5mL，2．0mL，2．5mL和3．0mL。加水至5mL。各加5mL基本培养基(2．11)。
4．4 样品试液管的制备 二组试管中分别加入1mL、2mL、3mL、4mL样品试液；各加蒸馏水至5mL，各加基本培养基(2．1．1)5mL
4．5 消毒 标准管及样品管，塞上棉塞，于98kPa压力下，灭菌15min。
4．6 接种和培养 待试管冷至室温，所有试管温度相同，且均匀，混浊度测定更应注意。
每管接种一滴接种液，直接滴在培养液内，勿碰管壁，于37℃培养72h，最短可减少12h或延长18h，必要时可在冰箱保存一夜再滴定，若用混浊度法，以培养18～24h为宜。
4．7 滴定 将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，用0．001%溴麝香草酚蓝溶液5mL，分2次淋洗试管，洗液倒入三角瓶中，以0．1mol／LNaOH溶液滴定，呈绿色即为终点，pH约6．8。以一瓶滴至终点的溶液作比较标准，30min后更换，时间久颜色变浅。
混浊度测定法，用混浊度计或640nm的比色计测定。
5．分析结果的表述
用不同浓度的标准烟酸液和滴定时所需的0．1mol／LNaOH毫升数，作标准曲线。
由样液滴定所需的0．1mol／LNaOH溶液毫升数在标准曲线上查出每管试液含烟酸量。
用不超过平均数10%的滴定值求出每毫升样液含烟酸量。
式中 ρ——样品提取液平均浓度，μg／mL
V——最终体积，mL
K——稀释倍数
m——样品质量，g