嗅鞘细胞体外分离、纯化及培养

出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第521页（3651字）

如上所述，嗅鞘细胞移植是治疗脊髓损伤最有前景的方法之一，但嗅鞘细胞的来源有限。所以，为了有效地支持有关嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的各种研究，探索一种简单有效但又不是太昂贵的纯化、培养方法非常有必要。下面简单介绍一到两种作者认为比较简单而又有效的方法。因为目前关于嗅鞘细胞的研究大部分以大鼠为实验对象，故以下所介绍的方法是以大鼠的嗅鞘细胞为基础，如为其他哺乳动物则仅供参考。

Chauh等取材新生大鼠的嗅神经和嗅球组织，通过应用阿拉伯糖苷胞嘧啶和抗Thy1．1单克隆抗体在原代培养物中去除成纤维细胞和星形胶质细胞等干扰细胞，获得了纯度达96%～99%的嗅鞘细胞。Bamett等应用O4抗体联合荧光活化细胞分类法成功分离、纯化生后7天大鼠的嗅鞘细胞，培养成活的嗅鞘细胞进一步分化，表现出与在体内时不同的表型特征。上述研究取材对象是未成年大鼠，获得的嗅鞘细胞与成年动物的嗅鞘细胞相比有其不足之处：①成年动物嗅鞘细胞的生长环境与其成年靶动物移植部位的生长环境相似，利于嗅鞘细胞发挥其独特的功能特性；②成年动物的嗅鞘细胞，不像取材于未成年动物的嗅鞘细胞会进一步分化，它们已经发育成熟，分化完全，表现稳定的生物学特性。Ramon-Cueto等根据在原代培养的3种细胞中只有嗅鞘细胞表达P^75NGFR的原理，应用抗体标记分离法获得了纯度约90%的嗅鞘细胞。但是Nash认为此种方法嗅鞘细胞的产量过低，使用的抗体会影响细胞的功能，不适合应用于进一步的实验研究中。Cudino-Cabrera等应用免疫磁化珠联合P75抗体分离嗅鞘细胞，也获得了97%较高纯度及较高产量的嗅鞘细胞。但是纯化后的嗅鞘细胞在培养后1个月内带有免疫磁化珠，影响后继实验进行。Nash等根据培养的3种细胞对不同替代底物具有不同的贴壁率的原理，通过将原代培养细胞连续数次转接于光洁的玻璃／塑料器皿上，获得了93%较高纯度以及较高产量(1．02×10⁶／只大鼠)的嗅鞘细胞。由于没有应用其他的生化试剂，纯化后的嗅鞘细胞更适合用于后继实验研究。以上几种方法都是比较成熟的培养成年大鼠嗅鞘细胞的实验方法。下面详细描述Nash等培养、纯化方法。

200～250克的SD大鼠(Sprague-Dawley rats)作为取材对象，用10%的水合氯醛麻醉后断颈处死，做一从鼻尖到枕骨纵行切口，去除鼻骨和额骨，在无菌条件下分离嗅球及部分嗅神经丝，迅速将其放入10ml不含钙离子和镁离子的冰冻Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)中。所取组织被轻轻地剥离去除脑膜和血管后再放置于10ml冰冻的Hank’s平衡盐溶液中，然后切开嗅球保留其最外面的两层，即嗅神经层和颗粒层，将这两层和神经丝一起放入10ml冰冻的Hank’s平衡盐溶液中，切碎、研磨，用0．1%的胰蛋白酶在37℃、5%CO₂消化15分钟。胰蛋白酶作用可用含有血清的培养基抑制(培养基的具体成分详见参考文献)。所得细胞被离心两次(1000rpm，10min)。为了确定活性细胞的数量，可将离心所得的细胞团块置于1ml培养基中制备成混悬液，用一滴台盼蓝与一滴细胞混悬液均匀混合并用血细胞计数器计数，活性细胞即未染色的细胞被计数，每3对嗅球大约可以产出5．1×10⁶个细胞。此细胞混悬液被种植于无盖的载玻片上，37℃、5%CO₂条件下孵育18小时，在此期间大多数的成纤维细胞贴壁生长，这一过程所得的上清液种植于另一张载玻片并在37℃、5% CO₂条件下孵育36小时以至于使星形胶质细胞贴壁，而嗅鞘细胞在96～120小时内不会贴壁，所以绝大多数嗅鞘细胞保留在上清液中。将此上清液种植于涂有一层多聚左旋赖氨酸的载玻片上，48小时以后嗅鞘细胞将贴壁生长，神经元在此培养条件下不会存活，所以此种方法可得到93%纯度的嗅鞘细胞。具体过程可看图22－9。每一步中贴壁细胞的百分数可见图22－10。

图22－9 嗅鞘细胞的纯化方案。最初的细胞悬液被种植于载玻片1上，18h后未贴壁的细胞被转移到载玻片2上，孵育36h后未贴壁细胞再被转移至铺有Ploy L-lysine载玻片3上

图22－10 在纯化过程中贴壁细胞的数量(表示百分数)(在第一步中70．4%的贴壁细胞是成纤维细胞。20．8%的是星型胶质细胞，6．8%是嗅鞘细胞；在第二步的贴壁细胞中27．9%是成纤维细胞，67．6%是成纤细胞，53%是嗅鞘细胞；在第三步中，贴壁细胞中仅有1．4%是成纤维细胞，5．9%是星形胶质细胞，剩下的93．2%被鉴定为嗅鞘细胞)

杨浩等在无菌条件下，分离大鼠嗅球，弃除软脑膜，分离嗅神经层及颗粒层，用D1-SGH(D1为无钙镁离子的Pucks液，SGH为庶糖，葡萄糖和HEPES的缓冲液)清洗2次，然后用0．125%的胰酶消化，37℃培养箱内作用25min。再用DF12完全培养基终止消化作用5min，于800rpm离心5min。加入无血清DF12培养基清洗1次。最后用含20%的FCS的DF12培养基将其制成单细胞悬液，以1×10⁶／ml的密度接种在经多聚左旋赖氨酸处理过的25cm²塑料培养瓶中，于37℃、5%的CO₂培养箱中进行培养，3天后半量换液，再培养2天后换成10%FCS的培养基。1～2天后在培养好的细胞中加人作用浓度为10^－5mol／L的Ara-C，36～48小时后换上新鲜的培养基，继续培养1天，弃去培养基，用无钙离子的Hsnk’s液清洗2次，然后用0．125%的胰酶+0．02%EDTA消化3～5min。消化时在倒置相差显微镜下观察，待细胞突起回缩、胞体变圆时立刻加入纯血清终止，其血清终浓度为20%。作用5min后，用火焰抛光的弯头滴管轻轻吹打瓶壁，收集细胞悬液于800rpm离心5min，弃上清，用含10%FCS的DF12将细胞稀释后，将培养上清连同未贴壁细胞弃去，用D1-SGH清洗培养皿2次，再用0．125%的胰酶消化1min左右，终止消化。加条件培养液(10%FCS+20μmol／LForskolin+20μg／ml的BPG+DF12)制成单细胞悬液，接种在多聚左旋赖氨酸和胶原双重处理过培养瓶中，于37℃、5%的CO₂培养箱中进行培养。将纯化好的嗅鞘细胞继续培养14天，分别在培养2天、4天、8天、10天、14天弃掉上清，用0．01M PBS清洗3次，接着用4%多聚甲醛固定1小时，再用PBS清洗3次，然后甲醇双氧水处理10min。PBS清洗后，加P75羊抗血清，按ABC法进行染色。将染色的细胞于明视野和相差显微镜观察，随机选视野(0．45mm²)并记数嗅鞘细胞阳性细胞的百分率。其结果发现2～14天的细胞纯度可达95%以上，且细胞纯度不随培养时间的延长而明显下降。

Barnett等利用脑部肿瘤患者手术切除的嗅球，通过应用磁化珠联合L-NGFR抗体纯化人的嗅鞘细胞，并在培养基中加入生长因子，获得了25倍于原代培养的嗅鞘细胞。Kato等则利用患者手术切除的嗅神经，用Chauh等方法培养成活人的嗅鞘细胞，并证实嗅鞘细胞具有和大鼠嗅鞘细胞相似的生物学特性。嗅鞘细胞的分离、纯化和大量生产，为进一步的实验研究奠定了物质基础。实验研究的结果最终要应用于临床，考虑到成年嗅鞘细胞的免疫反应性及自体嗅鞘细胞来源的困难性，沈慧勇等在国内、外首先开展了利用流产胎儿嗅球进行培养嗅鞘细胞的实验方法，并取得了成功，在其后续系列研究中，对该细胞的免疫学特性进行了评估。该课题组还利用大鼠为实验对象，成功地完成了对大鼠嗅鞘细胞－120℃超低温保存，并证实了超低温保存对嗅鞘细胞复温后的存活和生长没有影响，而且降低了嗅鞘细胞的抗原性，复温后的嗅鞘细胞与宿主融合良好。此实验方法可同样应用于人胚嗅鞘细胞并获得同样的效果。该项技术解决了将来嗅鞘细胞大量应用于临床脊髓损伤的细胞来源问题。在此简单介绍一下人胚嗅鞘细胞的分离、培养与纯化方法：5月大因意外引产胎儿，无菌条件下取出完整嗅球和部分嗅神经及嗅束，0．1%胰蛋白酶37℃消化15min后，移至聚左旋赖氨酸处理过的培养皿中，在含10%人AB型血清的DMEM／F12(1：1)培养液中培养，2天后贴壁细胞为细长的多极细胞和少量的荷包蛋样细胞，继续传代培养至2w，最后仅余多极的嗅鞘细胞贴壁生长。采用人抗神经生长因子受体抗体免疫细胞化学染色鉴定。纯化后的人胚嗅鞘细胞放入超低温冰箱冻存。