细胞培养应用潜力
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第203页（11189字）
(一)大量植株再生
许多植物种能经离体培养繁殖。大都用无菌茎尖或腋芽接种在培养基上，以满足诱导多芽形成。茎尖无性繁殖已用商品繁殖大量市场观赏植物。与此相反，愈伤组织、叶外植体或植物原生质体不能产生无性系。愈伤组织长期培养的再生植株，发生染色体不稳定，产生非整倍体。叶外植体直接再生植株，如莴苣和番茄，表现形态变异。马铃薯和甘蔗再生株，对病害反应不同，提出再生植株表现的这种变异性证明在农业上是有用的。因此，大量植株再生可应用于无性繁殖或产生新奇遗传变异性。
1．茎尖繁殖 观赏植物或育种母系和特奇突变体或变异体的繁殖，用常规方法(营养或有性)尚有困难或不可能。可用无性繁殖于商品生产。无性繁殖需遗传一致性植株。为了保证稳定性，常用有组织结构，放在简化培养基上。茎尖培养的标准方法：先将茎尖或腋芽表面消毒，接种在简化培养基上，促进形成更多芽。继而，将多芽分开，继代在生根培养基上。再生植株移栽土或泥炭钵，移至温室或大田。
Murashige(1974)描述三步培养法，各步常需改变培养基或生长条件。第一步，建成组织人工培养。第二步最重要，生根和移栽前炼苗。第三步要有高光强。许多种的第一、二步间无需改变培养基和培养条件。
细胞培养还可用繁殖某些作物：(1)种子生活力问题，育种或亲本系，组织培养产生的体细胞胚，能以用已建立的先发芽种子或移栽植株直接移栽大田。(2)突变植株，白化突变体或细胞遗传学有用的遗传品系，可用人工培养保存。(3)育种亲本，如用于商品生产的F1杂种的雄性不育突变体，离体培养繁殖保存雄性不育特性，供生产杂种种子长期选用。(4)鉴定的高级选系，重要的繁殖种子，以加速推广。为此，组织培养与有性繁殖相结合，繁殖无性系生产种子。如除虫菊工业化生产。(5)每个个体有价值的栽培作物，尤其是经济作物，如温室作物可用茎尖繁殖。离体培养繁殖要考虑经济效益、社会效益，力求生产成本低，生产量大，如杂交种子繁殖。
2器官发生和胚胎发生 外植体或愈伤组织可经器官发生或胚胎发生再生植株。器官发生培养法，常用不同培养基诱导芽、根形成。一般而言，细胞分裂素是生芽所需，生长素或降低细胞分裂用量，是成功的生根培养基。伞形科种最常见胚胎发生，虽有许多产生体细胞胚胎发生。培养期间芽、根发育在同一培养基上同时发生。能测出胚形成标准阶段(球形，心形，然后鱼雷形)。茎尖培养常产生遗传同一的再生植株，而器官发生，尤其叶细胞和原生质体常带来遗传变异性。初步报道胚胎发生产生的大量再生植株也是有变异的(如芹菜)。至今再生植株的限于豆科和禾谷类作物。多数种只有少数外植株能以再生。外植体源不能予见发育方式。某些豆科和禾谷类要求修改的MS盐类，以满足营养需要。
3．再生植株中体细胞遗传变异性 组织培养许多作物产生的表型变异可有农业价值，当能整合已有育种规划的话。它反映着已有细胞遗传差异或组织培养诱导的变异性。Skirvin等(1976)系统地将天竺葵种5个栽培品种愈伤组织再生植株，
牛儿茎切段活体取得的植株是同一的，而活体根和叶柄切段愈伤组织产生的有很多变异体。这提出至少有些变异性是供体外植体已有的。比较再生植株与亲本的植株和器官大小、叶、花形态、挥发油、鲜艳性、毛茸和花青素看到再生株的变异。很可能已有的和组织培养的变异性，共存于这些系内。
Syono与Furuya(1972)长期细胞培养体再生植株出现反常花部形态表型变异。这种愈伤组织和由其再生株会诱导产生染色体数变异，发育成非整倍体植株，对有性繁殖种有农业价值，而不会干扰无性繁殖作物如甘蔗和马铃薯的生产力。
Hoinz等(1977)深入研究甘蔗愈伤组织再生植株，观察到2n=71-300。经测验指出有些从感病亲本的再生株具有眼斑病、斐济病和粉霉病抗性，一系同时抗斐济病和粉霉病。正在把它们渗入常规育种规划。
最近分析了马铃薯叶肉原生质体再生株是高度可变的。有些是由于染色体重排。从甘蔗感病亲本Russet Burbank，鉴别出晚疫和早枯病抗性。Sibi(1978，1981)报道从莴苣和番茄愈伤组织再生株出现了可遗传变异性，但染色体未变。迄未从培养诱导的变异性育成作物新品种。Evans和Sharp(1983)提出番茄体细胞克隆变异的遗传基础。
4．体细胞胚移植大田 再生植株直接移栽技术包括先发芽种子移植，方法是液滴灌法，特别适用于能在人工培养体细胞胚胎发生的种。已取得满意结果，如番茄、莴苣、黄瓜、甘蓝，黄秋葵、南瓜、花茎甘蓝、芜菁、胡萝卜、玉米和芹菜。胡萝卜和芹菜已有体细胞胚。这种方法包含着：(1)在最适控制环境条件下种子发芽，(2)用胶类培养基与选出发芽种子相混合，以保护并使种子均匀分布在胶液中，和(3)用液播种机播种种子和胶。可提早均匀发育、早收获。
液播技术是离体培养繁殖的理想商用操作，所用胶像琼脂可加生长调节剂、植物营养、杀虫剂和其它植物保护剂。Bryan等(1978)列举了一些胶质物和液播机。
高频单体细胞胚胎发生同步胚发育和大规模收集同步胚的分开技术，是人工种子播种的先备条件。可用网筛或玻璃珠分开和收集体细胞胚。作为人工种子保存在发育中止状态备播种用。可用冷藏或有丝分裂抑制剂使之中止发育。如果是大田正常生长的移栽植株，也可采用机械移栽法，适用于蔬菜作物。
大量植株再生的商业应用汇综如表10-1。繁殖成本很重要，估计观赏植物每株13-25分，花茎甘蓝杂种离体培养繁殖每株11．6分。器官建成产生的新奇遗传变异可能成为新品种，用种子出售。如果新品种有特殊价值，离体培养再生成本可不计较。
表10-1 商业用大规模繁殖方式
(二)分生组织培养消除病毒
大量植物种植株茎尖分生组织病毒侵染浓度低，这涉及许多因子：分生组织内无维管束分化，阻碍着病毒胞间移动，和有丝分裂细胞的活跃代谢排除着病毒侵染。这种技术对一些作物或观赏植物种有经济价值。取无病毒外植体再生植株。当用有组织结构如茎尖帽盖培养时，再生植株代表着已有芽的增大和诱导生根。培养的分生组织再生株，常能保持表型和染色体稳定性。愈伤组织也能再生植株，虽常是无病毒的，但常见染色体反常性。这类再生株遗传一致性比已有组织的茎尖再生株为差。分生组织培养是取得无病毒植株的最常用方式。
1．分生组织培养技术 由于培养的外植体必须是无病毒的，常取活跃生长中的茎尖。分生组织常取自预消毒的幼株或保持在人工培养的芽培养体。茎尖分生组织为幼叶原基遮盖，常是无菌的，但常将暴露的叶表面消毒后，切取分生组织。常用75%乙醇或稀释次氯酸钠为消毒剂。由于有些种的茎尖对化学剂敏感，正确消毒方式需经预备试验肯定。
在无菌环境下，用解剖显微镜从茎尖取分生组织，幼叶原基多毛的种较为困难。把顶尖圆盖接种在固体培养基上，就可满足预组织的茎尖发育，和根发育。大多数种无荷尔蒙培养基即可。很早用White氏培养基，近来改用较高盐类浓度培养基如MS。附加生长素IAA或NAA可能是诱导生根所需。有些种在同样培养基上发育芽和根，多数文献提出诱导芽然后根的顺序培养基。不同光和温度对分生组织培养的重要性见本书第一卷。
许多因子影响着组织培养消除病毒的能力。芽的部位与大小，与外植体病毒存在有关。为利用无病毒细胞，应取最可能小的分生组织培养，小外植体不能像大的一样再生或生根。鉴别最适外植体大小时，必须考虑这二个因子的平衡。此外，顶芽的反应优于侧芽。
培养茎尖外植体前，常用热处理钝化病毒。许多情况下，34-35℃将能取得钝化病毒而无不良影响。约有半数已知病毒，尤其是小球形病毒，用热处理能使钝化。植株生长期间热处理结果，与未处理植株相比，能采用较大分生组织外植体培养。热处理植株后代有95%无病毒，生长于温室的植株茎尖只有15%无病毒。植株会因如连续热处理而受损伤，可改用间隙处理法。Walkey与Cooper(1975)用32℃培养黄花烟草分生组织，消除了某些病毒。TMV显示抗热性。
2．分生组织培养的应用 许多有经济价值的植物种，曾用分生组织培养消除病毒，如草莓花斑病毒，马铃薯病毒X，木薯嵌合病毒和花椰菜嵌合病毒。推定的无病毒母株必须经测验证实。用血清法检测病毒侵染，电镜观测，或侵染指示植物。如有适宜指示植物，侵染测验是病毒的极敏感检测法。无病毒植株显着增产，如无病毒马铃薯产量比侵染植株的较高60%。田间生长植株常能受病毒再侵染，应保存核心母株以供繁殖无病毒植株。
愈伤组织的再生植株，也能消失病毒侵染。愈伤组织细胞有丝分裂快速，维管束分化不完全，像分生组织一样。愈伤组织或细胞悬浮培养体通过反复继代，可完全消除病毒。烟草、天竺葵、唐昌蒲属和马铃薯曾从愈伤组织再生无病毒植株。总有染色体反常出现。
也可用未侵染的叶组织再生的植株。Murakishi与Carlson(1976)从TMV侵染叶的深绿色未侵染岛再生烟草植株，约50%无病毒。同样，Shepard(1975)从马铃薯病毒X侵染的烟草叶再生植株4140株中有7．5%无病毒。
(三)次生产物合成
培养植物细胞生产化合物(代谢产物)，与微生物培养有下列差异：(1)微生物生长比植物细胞快。(2)植物细胞把产物积存在细胞质里，而细菌细胞一般排泄产物。(3)植物细胞倾向于在稳定时期而不是指数生长阶段生产有用化合物。(4)微生物系统的遗传操作技术比植物细胞的先进，由此易于分离超产微生物。
为了取得需要产物最适产量，应控制几种条件：植物细胞能生长于集团培养体或发酵罐里。必要确定最适细胞收获时期，培养体稳定性，化合物的生产率。
应采用选择方法以鉴定稳定高产系。曾证明有些化合物在培养的细胞中的浓度可能比植物组织里的高，包括蒽酮，海象酸，谷胱甘肽和泛醌10。某些培养体中，需加高价前导物或生长调节剂，以生产商品要求的产量。积存很高浓度的需要化合物的变异体细胞系的选择曾有报道。以生理或遗传方法为选择的依据。多数学者根据改变培养基，环境的生长条件和收获时期选择生产力。生理选择可能是后生的，因此更难于控制。选择或可与突变剂处理相结合，以增高遗传障碍而不是后生变异产生的变异体的或然率。此法分离的突变体可能产生保持更稳定细胞系的结果。例如，有可能选择荷尔蒙自养生长，将能减少培养基成本。同样，光合自养细胞可利用CO2作碳源而不是葡萄糖和蔗糖生长。选择氨基酸衍生物或其它毒物衍生物，能产生氨基酸超产或其它有用物的突变细胞。一经选出，需保持其稳定性。应强调指出，如果微生物能制造这种产物的任何可能性，植物细胞生物合成将是不经济的。目前只有贵重药物有利于商品生产，日本正在研究植物细胞培养生产潜在有用化合物。
(四)单倍体生产
单倍体在作物育种中的重要性在于加倍后很快取得同质系和新品种。Kasha与Reinbergs(1980)报道采用加倍体可把大麦新品种推广从12年缩短到5年。单倍体植株可用于遗传分析。Burk(1970)证实了花药培养单基因异质二倍体产生二个单倍体亲本类型的1∶1比率。烟草单倍体用于分析控制抗病性的基因数和尼古丁生产，以及有助于分析人工培养诱导产生的突变和体细胞杂种。
发现花药培养中，有从2n花粉(未减数)产生的双二倍体，其自交子代是同质的(亲本是纯的)，还可有分离(亲本是杂种)。
1．产生单倍体植株技术 作物种经常规育种方法、花药培养或花粉培养取得单倍体植株。单倍体常用异种间杂种产生，大麦、马铃薯、烟草、玉米已应用于育种规划。大麦用大麦×球茎大麦，利用后者染色体优势丢失，产生单倍体。最近扩展到与血缘近的禾谷类作母本杂交生产单倍体。马铃薯野生种(尤其是S．phureja)花粉与马铃薯授粉，结果产生马铃薯孤雌生殖。马铃薯加倍体和单倍体有助于把野生种基因引入四倍体栽培种。栽培烟草×N．africana(父本)产生烟草单倍体。这些方法都产生母性单倍体。玉米花药培养产生的单倍体培育成纯系，用于生产杂交玉米。另一方面，玉米利用无限配子体(ig)基因产生核和质DNA独特的混合体。用杂合ig基因能生产父性和母性单倍体。棉花用海岛棉SJ57-4与陆地棉半结合杂交也能产生父性单倍体。凡此可用于细胞质DNA转移和核基因转移。
Guha和Maheshwari(1964)最先在南洋金花花药培养产生单倍体植株。现已有许多种能高频率产生单倍体组织和植株。首先要选择最好的培养的花药发育时期，使其发生频率最适合。烟草和蔓陀罗以花粉粒第一有丝分裂最好，番茄要取较早时期的，芸苔属则以较后期为宜。有些种培养的花药营养要求很简单，培养基不像花药时那样重要。另一方面，有些种如水稻品种，培养的花药反应是视培养基而定的。有许多因子影响着花药培养的成功。供体植株生长和年龄有重要性。接种前，离体花药预处理可能是重要的。冷和热处理能增高每个花药产生的单倍体植株数。
愈伤组织形成后，可经小孢子产生的单倍体细胞雄核发生或植株再生取得单倍体植株。Sharp(1983)最近综述，可知大多数种有直接雄核发生产生单倍体能力。分类类型对雄核发生和愈伤组织媒介再生表现不同。茄科大多数种能进行直接胚脂发生，而禾本科大多数种经由愈伤组织途径再生植株。已知产生单倍体的有：油菜、烟草、水稻、黑麦、马铃薯、玉米、石刁柏、辣椒、草莓、橡胶、大麦、甘薯、小麦、葡萄、和三叶草。
花药是二倍体和单倍体细胞的混合群体，全都有再生能力，着力于离体花粉培养。将花药放入液体培养基涂抹释放花粉，过滤收集之。游离花粉能培养在复杂培养基上或用看护培养。谷酰胺和丝氨酸是花粉培养基的重要附加物。
2．单倍体的应用 单倍体以同质二倍体系参加育种规划。二倍化单倍体系可用秋水仙素处理或用叶中脉培养产生。从加倍单倍体(尤其是F1群体)选择，结果使需要特性快速固定。
大麦育种曾采用加倍单倍体育成新栽培品种。烟草也一样。并已应用于石刁柏、芸苔、水稻、玉米、大麦、小麦、黑麦和马铃薯。石刁柏成熟雄株(XY)花药培养经染色体加倍产生超雄(YY)植株。用以与雌株(XX)杂交，对建立高产、全雄(XY)系十分有利(Dore 1974)。芸苔属用加倍单倍体技术，育成低硫代葡糖苷。水稻和辣椒也用加倍单倍体育成品种。玉米加倍单倍体利用加倍单倍体分析育种，加倍单倍体纯系用于评价育成品系的F1杂种亲本，由此更增强创制F1杂种的信心。
加倍单倍体也能用以遗传分析，研究质量和数量特性。由于单倍体和加倍单倍体表现配子基因型，遗传比率较不复杂(与用二倍体相比)。烟草几种数量特性遗传分析，曾用加倍单倍体植株的双亲后代，以估计Burley烟草群体的形态的、农艺的和化学特性。Choo等(1979)概述了利用加倍单倍体估计加性，和加性×加性遗传变量方法，单倍体用于细胞诱变，其隐性等位基因可得表达。花药培养也能用于操作体细胞杂种染色体数，和产生缺体，供遗传分析利用。
(五)细胞突变体的利用
植板单细胞和细胞水平上选择需要基因型的技术，提出细胞遗传学能用以产生遗传修饰的植物。采用细胞悬浮培养物能筛选大量细胞分离农业有用变异体。细胞遗传学成功地应用于农业要有下列条件：培养的细胞中鉴别的变异，能在再生植株中表达。运用诱变原生质体融合，或吸取外源DNA能导致变异，变异体植物必需加入常规育种规划，以育成新品种。这是最有希望的研究领域。
Chaleff(1981)综述了用培养的植物细胞分离突变体。常见诱导产生了化学剂抗性。曾用氨基酸衍生物抗性变异体细胞系了解氨基酸合成的生化途径。这些系常很稳定，即使从再生植株再启动培养体。其它抗性突变体曾用于描绘生化途径，包括玉米赖氨酸-苏氨酸抗性，烟草氯酸盐抗性和大豆溴脱氧尿苷抗性。
某些抗性突变体可能直接用于作物改良。除莠剂抗性能用于发掘某些种的有效除草规划。曾用细胞系选择2，4-D，paraquat和picloram抗性。离体培养分离出的pic loram抗性烟草突变体，曾经遗传学鉴定。植物毒素抗性可能以培养作物病原菌抗性品种。选出了玉米Helmintho sporium毒素抗性系和马铃薯Phytophtora毒素抗性系。前者是母性遗传。抗生素抗性对作物改良有特有应用价值。它受细胞质DNA编码，可能以标志特有植物细胞质。区分细胞质能力，有助于体细胞杂交研究，尤其是涉及细胞质雄性不育性转移，或其它细胞器编码的特性转移。
温室敏感／致死(ts)突变体和营养缺陷突变体发表文献较少。这些突变体可能是隐性，由此开掘单倍体细胞系尤为重要。可惜，单倍体细胞再生植株未能保留单倍体核型。例如，从普通烟草单倍体(n=24)分离的ts突变体，含有37个染色体，从单倍体南洋金花(n=12)分离出突变体未能再生。
原生质体融合常认为是培育出杂种植株的方法，这是常规有性杂交不可能成功的。采用改进的PEG法，可使任何二种植物细胞融合，独特体细胞杂种植株的创造，受离体植物原生质体再生植株能力的限制。
用纤维素酶和果胶酶溶于高浓度糖溶液，用于酶法消化植物细胞壁，取得原生质体。除去酶后，取二个种原生质体混合，用PEG或其它方法使之融合，淋洗，培养在适宜培养基中。
融合处理后，原生质体再生细胞壁，进行有丝分裂。必须在亲本细胞、同核体和异核体融合产物中加以区别。通常采用互补作用以鉴别融合产物，如白化突变体的相关，已用于蔓陀罗，胡萝卜，烟草和矮牵牛。曾设想采用氨基酸衍生物抗性和氯酸盐抗性突变体以鉴定体细胞杂种。蔓陀罗、胡萝卜、烟草、矮牵牛等四属曾产生了种间体细胞杂种。最近报道了四个种组合的异属植物：马铃薯十黄瓜，颠茄+南洋金花，拟南芥十油菜，胡萝卜+羊角芹和Nicotiana chinensis+Atropa belladonna。这些融合植物是不正常和不育的。尚未能用于作物改良。
原生质体技术应用的主要限制，当然是其不能再生植株。原生质融合能用以产生独特核-质组合，为常规育种所不可能取得的。随着细胞质遗传学信息的增加，从种内和种间融合产物取得愈大价值。还可作为育种系间转移细胞质控制的雄性不育性。
Evans等(1981)建立了烟草属产生独特体细胞杂种技。体细胞杂种的产生，导向产生农业有用体细胞杂种。内索非亚烟草叶原生质体与细胞悬浮培养体原生质体(来自栽培烟草白化突变体)融合，这种杂种植株的特征，是淡绿茎叶，还从形态、染色体，同工酶和遗传特性予以证实。用烟草嵌合病毒测验了加入的抗病性稳定性。这些体细胞杂种应能抗栽培烟草的许多病害，还用回交种子评价了病害反应。将把有用材料渗入育种规划，以产生抗性品种。
曾试图用外源DNA诱导高等植物转化。早期报道指向把外源细菌或植物DNA注射游离花粉粒，分析外源DNA命运的难点，阻碍着这种方法的广泛应用。Kleinhofs与Behki(1977)综述了整株试验的成果。最近，着重于游离植物原生质体和培养的植物细胞的转化。DNA转移成功，可能需要采用植物病原菌无功能DNA。曾设想采用浓杆菌Ti质粒和花椰菜嵌合病毒。由于DNA可为寄主细胞核酸内切酶所消化，可将外源DNA包裹在脂质体中以资保护。吸取DNA后，需要外源DNA的表达和稳定遗传。
总之，植物细胞培养潜在应用于作物改良是巨大的。细胞培养代表着诸技术的综合，仔细整合已有育种规划，结果应导致独特种质。此外，细胞遗传学技术不断创新，存在着改变未来作物种性质的可能性。即使仅采用分生组织培养技术和植株无性繁殖和遗传变异性，植物细胞培养即将对作物改良产生无可估量的推动力。
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