固相膜杂交法

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第105页（1812字）

本法是根据互补碱基顺序配对的原理，将分子量较大的无放射性单链DNA预先固定在膜上。与分子量较小的放射性标记的单链DNA(或RNA)在最适杂交条件下，使其互补碱基之间形成氢键，从而把两条单链连结成一种DNA×DNA(或DNA×RNA)的双链杂交分子，洗脱除去未配对的标记DNA片段。然而进行放射性测定，可求得两种DNA链杂交百分之几。

1．³H-DNA的制备

(1)细菌DNA的体内标记：根据细菌的不同生长要求而定，一般在细菌的对数增长期加3H-TDR，待细菌增殖到最大量时，离心收集菌体。

(2)标记DNA的提取：与未标记的DNA提取法相同。

(3)标记DNA的测定：放混合纤维素酯滤膜在过滤装置上，加5%TCA5ml抽滤洗膜1次，在含3H-DNA25ng的1ml溶液中加10%TCA1ml，沉淀³H-DNA。加在洗过的膜上抽滤，再加TCA5ml抽洗1次，取下膜放闪烁杯中。80℃抽真空干燥30分钟。加8ml闪烁液，测放射活性，一般可达到1×10³～1×10⁴cpm／ng。

DNA的同位素标记也可在菌体内，通过DNA酶I和DNA聚合酶I，将带有同位素的核苷酸加到DNA上去。近年来也发展了许多非同位素的DNA标记技术。

2．DNA膜的制备

(1)DNA的变性：用1SSC稀释DNA液为50ng／ml，加NaOH至0．1mol／L，煮沸10分钟，使双链DNA完全变性成单链DNA，立即放冰水中，用5mol／LNa₂HPO₄调pH至7～8，加等体积的12SSC，调DNA液约为6SSC，冰浴保存备用。

(2)DNA膜的制备：国产混合纤维素酯微孔滤膜(孔径0．45μ，直径25mm)在蒸馏水中充分浸泡后，置6SSC浸泡30分钟，放过滤器上，加5ml冷的6SSC抽洗膜1次，加变性DNA液4ml(25ng／ml)抽滤，抽速为1～2ml／分，再加6SSC5ml抽洗1次．取下膜至室温干燥至少4小时，放真空80℃干燥，2小时后备用，每块膜上约固定50ng的单链DNA。

3．DNA-DNA杂交

(1)标记DNA的剪切和变性：标记DNA用1SSC做定量稀释，在冰浴中50W超声剪切4次，每次15秒，再煮沸10分钟，立即放冰水中，用冷的6SSC－50%甲酰胺(即6SSC50%FA)稀释成1～1．5ng／ml备用。

(2)膜的预保温：将DNA放称量瓶(30×50mm)中，每张膜加1～2mlPM液(3SSC)中含有0．02%的聚蔗糖400，0．02%的聚乙稀吡咯焙酮，0．02%牛血清白蛋白)置65℃水浴6小时。

(3)杂交：吸出PM液，每片膜加剪切变性的标记单链DNA1ml，杂交最适此值是膜上固定DNA50μg加标记DNAlμg，在最适复性温度(TOR)下杂交45小时，使互补碱基顺序配对。

在6SSC－50%FA杂交液中，TOR的计算：

TOR=28．8+0．41×(G+C)mol%

(4)杂交膜的放射性测定：杂交完成后，用6SSC－50%FA漂洗膜1次。再用3mMTirs液5ml(pH9．0)漂洗2次，置膜于过滤装置上，加3mMTirs液5ml抽洗1次，放闪烁杯，在真空80℃干燥30分钟，加8ml闪烁液，液闪计数。

(5)杂交百分率的计算：以参考菌株同源杂交的计算为100%作为除数，以参考菌株和测定菌株的计数作为被除数，求出异源杂交百分率。并由此判定两者互补碱基顺序配对的程度，即菌株间的遗传亲疏关系。