离子色谱(IC)技术

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第149页（2814字）

(一)基本原理

被分析的检样各组份进入离子色谱分析柱后，在离子交换的树脂相内，由于离子吸附和排斥作用，强电解质离子首先被排斥出色谱柱；有机酸是弱酸，受到离子排斥作用较弱，可扩散至树脂相内。由于它们和树脂亲和力的不同而依次被分离，被分离的各组份随流动相流入微电导检测器，由于被检组份中离子的性质和浓度不同，而在电场中向电极迁移产生的电流强弱不同被记录下来，离子色谱分析是根据所测定色谱柱后流出物电导率的变化，再计算出各组份的含量。

(二)基本流程图(图3－3)

图3－3 离子色谱模式流程图

(三)测定方法

1．标准试剂 甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、丙酮酸、丙二酸、乳酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、盐酸、硝酸和硼酸，都为色谱纯或分析纯试剂。用于配制定量标准已知样，或测定时间作外标样。

2．色谱分离柱 有两种尺寸的色谱柱：100×8mm和200×8mm(内径)。色谱柱内填充的分离树脂为天津化学试剂工厂的YSG-SO₃－Na⁺树脂，在装柱前必须转化为H型(YSG-SO₃ H⁺)树脂。

(1)分离柱树脂的转化：将纳型树脂(YSGS3Na⁺)置于烧杯中，加入3倍树脂体积的2NHCl，搅拌后静置3小时，倾去上层清液。重复上述步骤一次，最后用蒸馏水洗至中性(用pH试纸)。

(2)装柱方法：转化得到的H⁺型阳离子交换树脂放入蒸馏水中浸泡，使其溶胀，搅拌均匀，立即用滴管柱入色谱柱内，每次约3ml毫升，迅速装入柱塞，启动输液泵，以1．5ml／分的流速装入蒸馏水，树脂迅速沉降。当树脂不再有明显沉降，上层为清液时，停泵，吸去上层溶液。再加入树脂，重复上述操作，直至装满色谱柱取下柱塞，放上过滤膜，装上进样头。

目前使用的YSG-SO₃^-H⁺树脂，膨胀和压缩性较大，所以装柱要适度，每天做完样品分析后，用蒸馏水反向冲洗柱子。

(3)色谱柱再生：为了保持高柱效率，使用一段时间后，用100ml 1N HCl冲洗。1N装入一个耐腐蚀和耐压的有机玻璃管中，此管连接在泵和色谱柱中间，这样可避免盐酸腐蚀泵体，由泵排送蒸馏水驱赶1NHCl通过色谱柱，继续用蒸馏水冲洗至柱后流出液呈中性(pH)为止。

3．分离条件选择

(1)流动相的组成：厌氧菌代谢产物中主要是短链脂肪酸和醇类，流动相的组成为：0．2～0．4MH³BO³+0．1～0．25MHNO₃(或HCl，或H₃PO₄均可)，这样各组份能得到良好的分离。

(2)柱长：因为短链脂肪酸中含异构酸，宜选用200×8mm色谱柱最好，流动相中HNO₃使用0．1～0．25mm即可。

(3)流动相的流速和进样量：在室温下进行分析时，流动相流速可在0．4～1．0ml／分之间选择，笔者选0．5或0．8ml／min流速。进样量视样品的情况，在5～100μl之间选择，笔者使用20μl／次。

4．定性测定 先分析标准的单一脂肪酸，确定其保留时间(tr)。一般来说，各有机酸的保留时间随分析样品的各组份在水中的离解数PK值增大而增大，除乳酸与流动相的硼酸有综合反应例外。再注入混合标准样品，确定各脂肪酸的出峰顺序和保留时间，根据这些规定确定被检样品的脂肪酸种类。

5．定量测定方法 定量测定方法有两种，一是校正曲线定量法，二是外标定量测定法。

(1)校正曲线定量法：在一定操作条件下，用纯样品配制成已知样，并稀释成一组不同浓度的标准样，用微量注射器注入一定体积与标准样进行分析，然后绘制出各组份峰高或峰面积与浓度(或重量)的关系曲线，描绘校正曲线图。待测样品在同样条件下分析，注入同样体积的样品，从色谱图上测得峰高(或面积)，由校正曲线图上查得各组份浓度值。

(2)外标定量测定：当被测样品中各组份浓度变化范围不大时，可不必做校正曲线，采用外标法，配制一个和待测组份浓度接近的标准样品，定量进样。由被检组份与外标组份峰高之比可算出被测组份的浓度，如下式计算：

式中：C为样品某组份浓度；h为样品某组份峰高；C₀为外标物浓度；h₀为外标物峰高；k为校正系数(实际上k即为直线斜率)。

(四)其他问题

1．影响色谱柱内离子交换过程的主要因素 离子溶质与离子交换剂的作用与分配系数密切相关，分配系数(k)值越高，其作用越强，则保留时间也越长。主要影响因素是离子电荷，离子大小，淋洗液强度，pH和树脂类型等。例如电荷的影响，一般来说离子价数越高，它对离子交换中心的亲和性越大，保留时间越长，而淋洗液所需浓度也越高。当然也有许多例外，如硫氰根(SCH)是一个大的可极化离子，它与阳离子交换树脂有较强的吸附作用，故其虽为一价离子，但保留时间仍较长。

2．样品的预处理问题 因为离子色谱通常使用水溶液作为淋洗液，所以水溶物的样品不需预处理，可得到最好的结果。

如果样品本身是不溶物时，则尽可能把样品粉碎至200目以下，然后用水萃取或用淋洗液萃取，并使用超声浴。

离子色谱分析样品一般需稀释，尤其是临床标本直接IC分析时(如胆汁)，使之不超过柱子的容量，建议对未知样先稀释100倍，以减少柱耗。但当样品浓度低于ppb时，则可使用柱上浓缩技术。

3．GLC分析和IC分析技术比较 根据笔者经验，两种技术各有优缺点，如表3－10所示。

表3－10 IC和GLC技术比较