气相色谱法介绍
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第136页（8706字）
(一)气相色谱分析原理概述
厌氧菌的终末代谢产物如醇类、挥发性脂肪酸、非挥发性脂肪酸等，这样的样品中各组份的沸点、极性等不同。它们在色谱中气相和固定液的液相间的分配系数也就不同，样品被气化后由截气带入色谱柱中运行时，各组份就在两相间(气相和液相)反复多次(103～106)的分配(即吸附－脱出)，色谱柱中固定相对各组份的吸附情况不同，因此各组份在色谱柱中运行速度也就不同，彼此分离，顺序地离开色谱柱进入检测器，故各组份的保留时间和出峰顺序也不同，进入检测器所产生的离子流讯号或从色谱柱流出的载气的热传导率(电阻改变)经放大后，在记录器上描绘出各组的色谱峰。因此根据色谱峰出峰顺序、保留时间，可以确定组份中物质，据色谱峰大小和面积可确定组份中物质的含量，再结合其他微生物性状可用于确定厌氧菌的菌属或菌种。
(二)分析的对象
作为厌氧菌终末代谢产物，主要有挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid即VFA)非挥发性脂肪酸(Nonvolatile fatty acid即NVFA)和醇等，这些都是人们使用GLC分析检材中的对象，其主要成分是短链脂肪酸和醇(表3－6)。
表3－6 厌氧菌终末代谢产物中主要经GLC分析的对象
注：产生lmeq／100ml以上量时记大写字母，以下量记小写字母。
(三)检测器的选择和比较
检测器大致可分为积分型检测器和微积分型检测器两大类。由于积分型检测器灵敏度低不能显示保留时间，故目前较少应用。在常用的微分型检测器中，根据推测原理的不同，又可分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器如热导池检测器(TCD)是检测载气中检材各组份浓度的瞬间变化，而质量型检测器如氢焰离子检测器，是检测载气中各组份进入检测器的速度变化。这两类检测器在厌氧菌终末代谢产物分析中最常用。
1．两类检测器的比较 根据笔者分析486株革兰氏阳性和革兰氏阴性无芽孢厌氧杆菌终末代谢产物的体会，两类仪器各有所长(表3－7)。
表3－7 两类检测器主要特征的比较
2．操作条件、柱填充物等有关资料 国外主要有VPI厌氧菌实验室手册介绍方法(下称VPI方法)，Wadsworth厌氧菌手册介绍方法(wad法)上野一惠等岐埠大学厌氧菌设施介绍方法(岐埠大学法)，以及笔者在首都医院和江西省科学院使用方法。分析内容、使用色谱柱、填充剂(包括固相和液相)、检测器类型、柱温和载气流量等列于表3－8，供国内使用者参考。
表3－8 色谱分析主要条件的有关资料摘录
3．检测器的选择和使用 VPI法只用TCD检测器，Wad法使用TCD和FID检测器，进行醇、挥发性脂肪酸(包括甲酸)、非挥发性脂肪酸、顶间隙气体等几乎全部终末代谢产物的分析。上野只用FID检测器进行除甲酸以外的挥发性脂肪酸、醇及非挥发性脂肪酸分析。一般来说，从临床检材分离的厌氧菌鉴定时，即使不能分析甲酸也没多大关系，认为有FID检测器即可。但是来源于正常菌群的厌氧菌鉴定时，甲酸对许多菌株鉴定有价值，故宜尽可能用TCD检测器。
根据多数作者的意见以及笔者的体会，厌氧菌终末代谢产物分析时，以并用TCD和FCD为好，用TCD来测定非挥发性脂肪酸的甲基衍生物、甲酸和氢气等，用FID来检测挥发性脂肪酸、醇类和其他挥发性有机化合物，这样才是最理想的。
(四)填充剂和色谱柱
检测器中关键部分是色谱柱，色谱柱中由柱管和填充剂两部分组成，填充剂又称“固定相”，大致可分为液体固定相和固体固定相定相两大类。笔者使用GLC分析是使用液体固定相。关于柱管，一般内径为2～4mm，长度为1～10m，可由不锈钢、铜、玻璃、聚四氯乙烯管等构成。根据实验条件如柱温、柱压的高低，检材的性质、腐蚀性等选用某种材料制成柱子。如VPI法选用不锈钢柱，上野法选用硼硅酸玻柱。一般来说，柱子越细越长效果越好，分离率高，出峰越锐利。目前还有不少资料报道使用毛细管柱，其内径一般为0．2～0．5mm，长度为30～300m，由不锈钢或玻璃柱拉成，其能更有效分离至许多普通管柱不能检出的芳香类脂肪酸，对厌氧菌的鉴定极为有利。充填剂一般由固定液和担体构成(又称固定相)。担体又称为载体或固体支持物，是一种颗粒状、多孔性的惰性化学物质，并且有一定表面结构和特性，把固定相涂于载体表面形成均匀的薄膜，就成为固定相(填充剂)，其选择已在表3－8介绍，不再赘述。
下一个问题是填柱。虽然可购买到商品化的色谱柱，但自装一根柱子也并不复杂。首先清洗柱子，用溶剂抽洗除去脏物，然后用水冲洗干净，再把洗净柱与高压氮气瓶连接并通气。热柱，把整个柱子沿柱长放在本生灯上加热呈暗红色，这一过程使柱壁可流失物出来，以避免填充柱后分析时的基线不稳定和异峰出现。填充剂的量可根据柱体积，担体重量，假比重等折算出所需要的担体量和涂料的量，具体公式为：
V=π／4D·2DL
L为柱长，D为内径，V为所需载体的体积，然后用量杯量取计算值V的1．2～1．5倍的载体在天平上称重。再按配比称取固定液。载体经酸洗、烘干后，按配比(即固定液与载体的重量比)加入固定液涂渍。然后装柱，在柱的一端塞上一些硅熔化的玻璃棉，此端与水泵相接，柱的另一端安上一小玻璃漏斗，填充物从漏斗中加入，此时打开水泵，边加边轻轻地敲打柱子。添加时，一小部分一小部分地进行，直至柱子装满为止。填充后注意老化色谱柱，将色谱柱装好，接通载气，流速为5～10ml／分，高于柱温5～10℃(要低于最高使用温高)老化4～8小时，从而把残存溶剂、低分子量固定液赶走，以便使记录器基线平直，并在老化温度下，使固定液在载体表面有一个再分布过程，因而涂的更加均匀牢固。注意：老化时柱子要和检测器断开，以免污染。
(五)色谱分析中常使用的培基
在进行厌氧菌代谢产物的气相色谱分析时，操作条件和方法稳定后，分析的结果受用于色谱分析的培基影响较大，培基影响着被检菌株的生长，也就影响着菌的代谢物的产生，现今厌氧菌分类是基于VPI手册，因而在为厌氧菌鉴定时最好依据VPI的方法，使用PYG培基的培养液分析。然而此种PYG培基是预还原灭菌培基(PRAS)，即所谓在气体(无O2的CO2气)喷射法制作的培养，这不但制作时需一定的条件，且效果也不如其他培基满意，如上野使用GAM培基，还有schadler肉汤，lombard-dowell葡萄糖肉汤，以及笔者曾使用改良庖肉培基，在此简介如下：
1．经典的PYG或PY培基
蛋白胨(Difco) 10g
酵母浸膏 10g
刃大青 0．4ml
盐溶液 40ml
L－盐酸半胱氨酸 0．5g
鲜肉汤(或蒸馏水) 1000ml
PYG培基则加葡萄糖 10．0g
其中盐溶液(又称PYG盐溶液)为：
氯化钙 0．2g
硫酸镁 0．2g
磷酸氢二钾 1．0g
氯化钠 2．0g
蒸馏水 1000ml
2．GAM培基或GAMG培基
蛋白胨 1%
胨 1%
植胨 0．3%
牛肉浸膏粉 0．2%
消化血清末 1．35%
酵母浸膏 0．5%
可溶性淀粉 0．03%
肝浸膏粉 0．12%
硫乙醇酸钠 0．03%
磷酸二氢钠 0．25%
氯化钠 0．3%
L－盐酸半胱氨酸 0．03%
蒸馏水 1000ml
GAMG基即加葡萄糖 1%
3．CMH培基或CMHG培基
鲜肉汤 1000ml
胰蛋白胨 1%
酵母浸膏 0．5%
L－盐酸半胱氨酸 0．05%
磷盐溶液(同PYG) 4%～5%
0．05%氯化血红素溶液 1000ml
0．5%维生素K溶液 2ml
pH7．0
装置时以5∶1的比例加入上述培基和庖肉渣。CMHG培基即加入1%葡萄糖至上述培基中。
4．Cmd培基和CmdG培基 同于培基3，仅以0．5%消化血溶液替代0．05%氯化血红素溶液。含糖培基加入1．0%葡萄糖溶液。
(1)氯化血红素溶液的配制：氯化血红素50mg溶于1N的NaOH溶液中，再加蒸馏水至100ml。经121℃，15分钟高压灭菌，置4℃冰箱保存(最后浓度为5mg／ml)。
(2)消化血液的配制：脱纤维兔血50ml，生理盐水150ml，浓盐酸6ml，胃蛋白酶2g，消化过夜，次日用20%NaOH溶液调pH至7．2，置4℃冰箱备用。
(3)维生素K1溶液的配制：0．2g甲痠醌溶于95%乙醇20ml中，经细菌滤器(0．2μm)滤过灭菌，盛于棕色瓶中，置4℃冰箱备用(最后浓度10μg／ml)。
(六)衍生物的制备和分析
一般说来FID检测系统不需要制备衍生物，而可直接用水溶液的培养物进行分析。但是为避免乳酸、琥珀酸等分析时所要求的高温破坏，故最好制备成甲基或丁基衍生物进行分析。而用TCD分析时必须制备成甲基衍生物才能进行分析，制备成甲基衍生物以氯仿提取后具挥发性方可分析。
有两种溶液可用来制备检材的甲基衍生物，一种是1．4%三氟化硼－甲醇溶液，另一种是硫酸－甲醇溶液，两种方法的结果类似。笔者使用的是后一种。体会是在培养物中加入硫酸－甲醇溶液后，置60℃水浴中约1小时，或在室温下过夜更好，以保证检材最大量的NVFA的甲基化。此外，笔者曾使用CAPCO厌氧菌分析系统(TCD)将VFA分析时，曾出现甲酸出峰不佳的情况。这可能与甲酸往往存在于醚水交界处提取未净有关；或在操作过程中载气流速过快，以至于甲酸峰未出现便被掩埋等有关，值得分析工作中注意。
1．醇和VFA的分析 取培养物5ml，加50%H2SO40．1～0．2ml，使pH2．0以下，再各取1ml酸性培养物至2支试管内，直接注入法就可以取1～2μl注入FID检测器分析。而醚提取法，将酸性培养物加入乙醚1ml，充分振摇，再经750～1000转／分离心，用吸管吸出醚层至另一装有无水氯化钙粉的试管内，再取1～3ul用于分析。
2．NVFA的分析 取培养物2ml，加入50%H2SO4溶液调整pH2．0以下，如为三氟化硼甲醇法，则取1ml硫酸酸性培养物至试管内，加入三氟化硼甲醇盐溶液1ml，经5分钟煮沸或60℃水浴箱中1小时，或置室温下过夜，次日加入0．2～05ml氯仿，离心(1000转／分)后取氯仿层进行分析。如为甲醇硫酸法，则取1ml硫酸酸性培养物至试管内，加入甲醇(水)溶液1ml和50%H2SO40．1ml，经5分钟煮沸或60℃水浴箱中1小时，再加入去离子水1ml和氯仿0．2～0．5ml，静置片刻，经离心(1000转／分)后取氯仿层进行分析。
(七)标准脂肪酸的制备
标准脂肪酸经过上述方法处理后，由GLC分析，确定各脂肪峰出峰顺序，保留时间(定性分析)和峰高、峰面(定量)，以便作为待检菌株的对照，用以比较确定待检菌株脂肪产生及其量。虽然标准脂肪酸有商品出售(BBL)，但一般实验配制标准脂肪酸也不难，配制方法如下：
1．VFA标准液 用100ml容量瓶装入以甲酸到乙酸共9种酸(色谱纯)，分别制备1M溶液各100ml(贮存液)：
甲酸 3．7ml／100ml
乙酸 5．7ml／100ml
丙酸 7．4ml／100ml
异丁酸 9．3ml／100ml
丁酸 9．2ml／100ml
异戊酸 10．9ml／100ml
戊酸 10．8ml／100ml
异己酸 12．5ml／100ml
己酸 12．5ml／100ml
取上述1M溶液各1ml装入容量瓶中，以量筒加蒸馏水100ml，或为含1毫克当量标准溶液。
2．NFA的标准溶液 用100ml容量瓶装入85%乳酸0．084ml，琥珀酸加0．06g，丙酮酸0．068ml，苯乙酸0．06g，加去离子水至100ml，成为含各组分1毫克当量的标准溶液，冰箱保存。
3．醇的标准液 用100ml容量瓶装入从乙醇到戊醇的如下6种醇，用量筒加蒸馏水至100ml。
乙醇 0．1ml
丙醇 0．005ml
异丁醇 0．005ml
丁醇 0．01ml
异戊醇 0．0005ml
戊醇 0．0005ml
标准液的提取方法如上述，经色谱分析后制备标准的色谱图，以确定保留时间和出峰顺序，并以标准剂量用以计算待检菌株VFA、NVFA及醇的产量。
(八)气液色谱的操作方法
GLC分析的操作，首先是操作条件，也就是设置参数。如载气的流量，入样口的温度，检测器的温度和衰减等。尤其是载气流量和柱温对保留时间的影响较大，影响脂肪酸的出峰，也影响检材的处理时间，柱温随使用填充剂的种类而改变，入样口的温度直接影响检材的气化，它的选择取决于检材的挥发性、沸点、稳定性、进样量等多种因素，气化温度一般选在检样的沸点或稍高于沸点，以保证检材的迅速完全地气化，详见表3－8，不再赘叙。
(九)结果判断
在进行色谱分析时，除了先分析标准样品以外，应注意空白对照分析，即同批制作未接种培基，以同法提取行GLC分析，最好每天与待检菌株GLC分析同时进行，最少一周做1～2次。一般培基中含有少量乙酸、丙酸、琥珀酸(或相当于琥珀酸保留时间的其它成分等)，培基成分越复杂则其含量比越多。上野曾指出用于糖分解的培基中，原来就会含有相当量的乙酸，而加葡萄糖培养基高压灭菌后，乙酸含量有所增加，故决定待检菌株乙酸量时要慎重。笔者在制作PYG培基时，也曾发现乳酸含量较多，因此这种未接种菌的培基空白对照分析所含多成分的峰形，为待检菌株色谱分析结果判断做必要的修正。待检菌株的分析结果与标准溶液分析结果比较，分析各峰的保留时间，以决定各峰顺序、名称，确定待检菌株的出峰情况，并将参阅《VPI厌氧菌实验室手册》所分析标准菌株图谱加以进一步识别。
《VPI厌氧菌实验室手册》中多成分的量由比1meq／100ml多或少决定之。比1meq／100ml多时，则多成分以第一个字母大写记录之：A、P、IB、B、IV、V、IC、C、L、S等。若少于1mol／100ml时，则以小写字母表示：a、b、ib、b、iv、v、ic、c、l、s。量的精确计算可由峰面积计算，较多的仪器(如GC－7A色谱仪)可自动数字显示。
分析过程中对一些菌属或菌种的鉴定可用含糖和不含糖两套培基进行，培基中含葡萄糖与否，与待检菌株对糖的酵解情况不同而有差异。因此并两种培基分析，既有利于了解被检菌株的代谢产物情况，且有时对有些菌株的鉴定也有所值。如牛岛疆曾报道索氏梭菌(C．Sordellii)与艰难梭菌(C．difficild)，索氏梭菌与生孢梭菌(C．sporogenes)可根据含糖培基的VFA分析结果相鉴别，但不能区别艰难梭菌与生孢梭菌。后两者可根据不含糖培基的VFA分析结果鉴别之。
(十)厌氧菌主要菌属和菌种代谢产物的产生(表3－9中)
表3－9 厌氧菌主要菌属和菌种代谢产物产生情况
