胡萝卜素的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第185页（3744字）

胡萝卜素主要存在于植物中，有a－、β－等几种异构体。其中β－胡萝卜素生理功能最强，胡萝卜素常和叶绿素，叶黄素等共存于植物体中，测定时需把它们分开。本法采用分离层析法，利用吸附剂对不同色素的不同吸附能力，将样品提取液中的胡萝卜素分离出来，在波长450nm处，进行比色测定。

试剂

(1)丙酮。

(2)石油醚：沸程：①30℃～60℃，②60℃～90℃。

(3)无水硫酸钠。

(4)脱脂棉。

(5)氧化镁。

(6)50%氢氧化钾溶液。

(7)0．5N氢氧化钾溶液。

(8)乙醇(脱醛)。

(9)1%酚肽指示剂。

(10)1%洗脱剂：1毫升丙酮与99毫升石油醚(60℃～90℃)混合。

(11)5%洗脱剂：5毫升丙酮与95毫升石油醚(60℃～90℃)混合。

(12)胡萝卜素标准溶液：准确称取β－胡萝卜素0．05克，加入少量的氯仿溶解，以石油醚稀释至50毫升(1毫克／毫升)，此为贮备液。

标准工作液：吸取1毫升贮备液，以石油醚定容至100毫升容量瓶中。

(13)0．02%重铬酸钾溶液：此溶液可以代替胡萝卜素标准溶液。

①0．02%重铬酸钾标准溶液在波长450nm处的光密度，相当于每毫升石油醚溶液中含1．12微克β－胡萝卜素在450nm处的光密度。

②1毫升0．02%重铬酸钾标准溶液相当于1．12微克的胡萝卜素。

操作步骤

1．样品的提取

(1)新鲜水果蔬菜：称取切碎样品1～5克(约含胡萝卜素50～100微克)，于研钵中，加入10毫升1∶1丙酮－石油醚(30℃～60℃)混合液，研磨5分钟，静置，将上层清液转移至一盛有100毫升水的分液漏斗中。每次以毫升1∶1丙酮－石油醚混合液，研磨，冲洗残渣数次直至冲洗液无色，将冲洗液合并于分液漏斗中。摇动分液漏斗约1分钟，静置，待分层后，将水液层放入另一分液漏斗中，再以30毫升水冲洗盛有石油醚的分液漏斗，如此3～4次，每次均摇动，静置，分层，将下层水液全部合并到第二个分液漏斗中(如此可将丙酮洗除)。

再向第二个分液漏斗中5～10毫升石油醚，摇动提取残留的样品，静置，分层后，弃去下层水液，把此石油醚液，合并在样品漏斗中，向合并的石油醚样品溶液中，加少许无水硫酸钠，摇振后，装入层析柱进行分离。

(2)干制植物性样品：称取磨碎样品1～5克，置磨口锥形瓶中、加入20毫升3∶7丙酮－石油醚(60℃～90℃)混合液，在水浴回流1小时或加上塞子，置室温暗处15小时以上。将瓶内上层清液倒入一盛有100毫升水的分液漏斗中。并以5～10毫升石油醚，洗提残渣数次，至洗提液无色，合并全部洗提液于前分液漏斗中。

摇动分液漏斗一分钟，静置，待分层后，将水液层放入第二个分液漏斗中，以少量水冲洗盛有石油醚的分液漏斗3～4次，将水液全部集中在第二分液漏斗中。向盛水液的分液漏斗加入5～10毫升石油醚，摇动，静置，弃去水液层，把石油醚液合并到样品漏斗中，向合并的石油醚样品溶液中，加少许无水硫酸钠，摇动后装入层析柱进行分离。

(3)动物性及其他含脂肪样品

①皂化：称样品1～5克，置磨口锥形瓶中，加入50%氢氧化钾溶液5～20毫升，脱醛乙醇20～40毫升，于水浴上回流1小时。以10毫升水冲洗冷凝管，当溶液不浑浊时则表示皂化完全。

②提取：取下皂化瓶，冷却后将皂化液转移至分液漏斗中，用30毫升水分两次洗皂化锥形瓶。再以50毫升石油醚分两次洗皂化锥形瓶，全部洗液合并于分液漏斗中，轻摇分液漏斗1～2分钟，有时启塞减低瓶内压力，静置分层，将水液放入第二个分液漏斗中。向第二个分液漏斗中加入石油醚30毫升摇动，静置分层，将水溶液放入原锥形瓶中，石油醚液并入第一个分液漏斗中。将原锥形瓶中水转入第二个分液漏斗中，加入30毫升石油醚，如前重复提取3～5次至石油醚层中不显黄色为止。

③洗涤：向第一个分液漏斗中加水30毫升，振摇，静置分层，弃去水溶液。加入0．5N氢氧化钾20毫升，摇动，静置分层，放去下层碱液，再加水30毫升、摇动，静置分层，弃去水液，如此重复多次，至不使酚酞显红色为止。

④蒸发醚层：将醚提取液经无水硫酸钠滤入150毫升具塞锥形瓶中，用25毫升石油醚分次洗分液漏斗、滤纸和无水硫酸钠，洗液并入锥形瓶中。

将锥形瓶置于水浴上回收大部分石油醚至瓶中剩余5～15毫升时，停止蒸馏，冷却后待层析。

2．柱层析分离样品

(1)层析柱的制备：层析管规格：Ф1cm×20cm。

装少许脱脂棉于层析管下端，压紧，装入8～10cm高氧化镁，轻击管壁使其装填均匀，并将层析管置抽滤瓶上，抽气，将表面压平，加入1cm高的无水硫酸钠。

向层析管内加入约10毫升石油醚，抽气减压，使吸附剂湿润并赶走其中空气。以25毫升量筒接收渗滤液。

(2)层析及洗脱：当无水硫酸钠上面还留有少许石油醚时，即将样品提取液倒入层析管中。

以石油醚洗分液漏斗或锥形瓶，并冲洗层析管管壁，随浸提液的渗滤在吸附柱上逐渐形成色谱，并继续以石油醚洗柱体至吸附的胡萝卜素已与其他色素明显分开。

用5%或1%丙酮－石油醚洗脱剂洗柱体，当橙黄色胡萝卜素色层移过柱体中部之后，则开始以25毫升干净量瓶接纳渗滤液直至黄色全部洗出为止(一般加洗脱剂20～25毫升)。用石油醚定容至25毫升。最好胡萝卜素浓度为：2～4微克／毫升。

3．标准曲线的绘制：准确吸取胡萝卜素标准溶液(10微克／毫升)：0，0．1，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0毫升，置10毫升容量瓶中，以石油醚定容至刻度，在波长450nm处以石油醚作空白，用分光光度计测定其光密度。

以光密度为纵坐标，胡萝卜素浓度为横坐标，绘制标准曲线。

4．样品测定：将已定容至25毫升的，层析样品提取液，在波长450nm处，以石油醚作空白，用分光光度计测定光密度。从标准曲线查得胡萝卜素含量，并进行计算。

5．计算：

式中：V：收集层析液稀释后的总体积(毫升)

A：查标准曲线所得样品测定液中胡萝卜素含量(微克／毫升)；

W：样品重量(克)

100：换算为百分含量；

1000：换算微克为毫克数。

〔注〕①胡萝卜素易为阳光破坏，应避光操作。

②氧化镁应为160～200目，于600℃灼烧3小时后使用。

③渗滤液以每分钟滴40～70滴为宜。