分子筛色谱法分离提纯细胞色素C

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第223页（4403字）

细胞色素c是细胞色素的一种，细胞色素是一类含有铁卟啉基团的电子传递蛋白，只存在于需氧细胞中，细胞色素在线粒体内膜上起传递电子的作用，是呼吸链的一个重要组成部分。每个分子细胞色素c含有一个血红素和一条多肽链，各种来源的细胞色素c其氨基酸残基的数目在103～111之间，细胞素c中赖氨酸含量较高。等电点为10．7。含铁量为0．38%～0．43%，分子量为12000～13000。

细胞色素c是一种可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。细胞色素c氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素c对热稳定，同时可抵抗0．3N盐酸和0．1N氢氧化钾溶液的长时间处理。

细胞色素c氧化型最大吸收峰为408nm，530nm。还原型的最大吸收峰为415nm，520nm和550nm。氧化型细胞色素c在550nm处克分子消光系数为0．9×10⁴／克分子／厘米，还原型细胞色素c为2．77×10⁴／克分子／厘米。根据已知克分子消光系数可用分光光度法测定细胞色素c的含量。

细胞色素c常以心肌和酵母为材料进行分离制备。

(一)细胞色素C粗制品的制备

1．提取液的制备：取新鲜猪心，除去脂肪和结缔组织，洗净，用绞肉机绞碎，称取1000g猪心肌肉糜，加入1000毫升0．145M的三氯乙酸溶液，搅匀，于室温下放置3小时，于4000转／分离心15分钟，收集上清液，将沉淀按上述条件重提取1小时，合并两次提取液。用10%氢氧化钠溶液调至pH7．3，测量并记录此抽提液的体积，按每升溶液加500克硫酸铵的量，加入硫酸铵粉末，边加边搅拌，并静置30分钟，离心除去杂蛋白。再于搅拌下慢慢加入硫酸铵粉末(加入量按50克／升溶液计算)并放置过夜。然后离心(4000转／分，15分钟)除去沉淀，保留上清液。

2．粗制品固体的制备：将上述提取液，在搅拌下，每100毫升溶液加入2．5毫升20%三氯乙酸，立即于3000转／分离心15分钟，收集沉淀，此即为沉淀的细胞色素c。

3．透析：如果用分子筛色谱法提纯细胞色素c，此步骤可省略。

如果用离子交换柱层析法提纯细胞色素c，需要透析除去杂离子。将上述沉淀的细胞色素c，加入少许蒸馏水将沉淀溶解，装入透析袋中，对水透析4小时，使得到细胞色素c的粗制品溶液，也可以加入4倍体积的冷丙酮，使细胞色素c从溶液中沉淀出来。

(二)分子筛色谱法分离提纯细胞色素C

分子筛色谱又称凝胶色谱或凝胶过滤。分子筛色谱是指混合物随流动相经固定相(凝胶)的色谱柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。

凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质。凝胶的每个颗粒的细微结构就像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔。大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具有分子筛的性质。

当混合样品加入到色谱柱中时，这些样品随洗脱液的流动而移动，分子量大小不同，其流速也不同。分子量大的物质，沿凝胶粒子间的孔隙随洗脱液移动，流程短，移动速度快，先洗出色谱柱，而分子量小的物质，可通过凝胶网孔进入粒子内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后流出色谱柱。

分子筛色谱的基本原理是按被分离物质，分子量的大小，分别先后流出色谱柱，大分子先流出，小分子后流出。

1．分配系数Kd：

分子筛色谱柱的总床体积(V^t)为：

V^t=V^o+Vⁱ+V_m

表9 交联萄聚糖的技术数据

式中：V_o为凝胶颗粒之间液体的体积(即外水体积)。

V_i：为凝胶颗粒内所含的液体体积(即内水体积)。

V_m为凝胶颗粒本身的体积。

每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数(Kd)所以它的洗脱体积V_e为：V_e=V_。+K_dV_i

当K_d=0时，则V_e=V_。，此时被分离物质(大分子)完全不能进入凝胶颗粒内，而最先洗脱下来。

当K_d=1时；即V_e=V_。+V_j，此时这种物质(小分子)完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中最后流出来。通常0＜K_d＜1_。K_d越大，进入凝胶内的程度越大，在中间情况下，例如K_d=0．5时，其洗脱体积V_e=V_。+0．5V_j。

上式中总床体积Vt，可由圆柱形色谱柱的体积计算()，测定外水体积(V_o)，可采用蓝葡聚糖2000，作参照物，其洗脱体积就等于V_。。V_j的测定则可选用一个自由扩散的小分子(如中性盐类)通过色谱床，此时K_d=1，则V_j=V_e－V_。。

分配系数(K_d)是分子筛色谱的一个特征常数，即被分离物质在流动相和固定相之间分配的比例。

2．交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖、分子间主要是α－1．6糖苷键(约占95%)，分枝为1．3－糖苷键(占5%)，以3－氯－1．2－环氧氯丙烷(Cl－CH₂－CH-CH₂)为交联剂，将链状结构连接成为三维空间的网状结构的高分子化合物。交联度越大，网孔结构越紧密，交联度越小，网孔结构越疏松。

葡聚糖凝胶是一种化学性质比较稳定的物质，不溶于水，弱酸，弱碱和盐溶液，也不溶于一般有机溶剂中。目前在分子筛色谱中，已成为最常用的凝胶，商品名为Sephadex。

由于Sephadex中有许多亲水性羟基，故干胶有很强的吸水性，吸水性主要取决于网孔大小，不同型号的Sephaex用G表示，在G后面的阿拉伯数字为凝胶得水值再乘以10，G值越大，得水值越大。

3．凝胶的选择与处理：分离细胞色素c，可选用SephadexG－75或G－100型凝胶，凝胶颗粒一般在40～120微米。

葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂(本实验的洗脱剂为水)的相同液体中。充分溶胀，然后才能使用。

根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积，计算所需凝胶干粉的重量，用过量的洗脱液，溶胀凝胶。不要过分搅拌，以防颗粒破碎。最好在沸水浴上溶胀凝胶，可以大大缩短时间，还可以杀死细菌和霉菌，同时还可以排除凝胶内部包藏着的气泡(见表9)

4．装柱：选择柱内径2～3cm，高80～100cm均可。在装柱前先将凝胶上面多余的溶剂倾出，然后将凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降。要注意颗粒间无夹杂气泡。凝胶沉集后，将多余溶剂放出，并且再通过2～3倍床体积的溶剂使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防加样时凝胶被冲起。

5．加样：将以上制备的细胞色素c粗制品，加少许蒸馏水溶解，加样量为100毫升床体积加样20～30毫升。此为制备用的加样量(20%～30%)。分析用量一般100毫升床体积加样1～2毫升(1%～2%)。

加样时，将柱中多余的洗脱液(水)放出，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开管夹，使样品溶液流入柱内，凝胶表层。然后加入洗脱液(水)。

6．洗脱：洗脱液与溶胀凝胶所用的液体应相同，本实验的洗脱液为蒸馏水。

交联度大的凝胶(G－10－G－50型)流速与柱的直径无关。交联度小的凝胶(G－75－G－200型)流速与柱的直径有关。并在一定的操作压下，有最大的流速值。流速也受颗粒大小的影响，颗粒大时，流速也大。但流速大时洗脱峰常较宽，颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。本实验约2小时左右即可完成。

细胞色素c为红色，收集红色洗脱液部分即为液体纯制品，如制固体样品，可在真空冷冻干燥机上制备。

此法的优点是：不必事先透析脱盐。利用凝胶色谱法，可脱盐、提纯细胞色素c一步完成。

7．凝胶的再生和保存方法

(1)防霉方法：常用的抑菌剂有以下几种：

①叠氮钠(NaN₃)：易溶于水，使用浓度为0．02%。

②洗必肽(双氯苯双胍己烷：使用浓度为0．002%，能抑制几乎所有细菌的生长，但抗真菌的作用不明显。

③三氯丁醇(可乐酮)：使用浓度为0．01%～0．02%，在微酸性溶液中，杀菌效果最好。在碱性溶液中或高于60℃时易分解而失效。

(2)膨胀状态：在水相中保存时，加入上述防腐剂或加热灭菌后，于低温下保存。

(3)干燥状态：加入含乙醇的水洗，并逐步增大乙醇含量(如70%、90%、95%的乙醇含量)。再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于60℃～80℃干燥后保存。