微柱层析法检验黄曲霉毒素

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第238页（2565字）

方法一：适用于每公斤样品中黄曲霉毒素含量10微克以上。

黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物。目前已经发现的17种黄曲霉毒素，均为二呋喃香豆素的衍生物。

根据其在波长365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光，而分为B组和G组。又根据在硅胶薄板上分离的R_f值不同，分为B₁、B₂、G₁、G₂等。B₁、B₂在生物体内可以转变为M₁M₂。其中被污染的粮油食品饲料中只有B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂六种。最易污染的是花生、玉米、棉籽、可可籽、椰子和咖啡等。对易霉变的霉蛋、蛋粉、肉松、火腿、腊肠、乳和乳制品也要注意检测。

黄曲霉毒素是损害肝脏的毒素，急性中毒可引起肝脏坏死出血，肝细胞褪变和胆管上皮细胞增生等。慢性中毒可引起肝癌。它是公认的最强烈的一种自然致癌物质。以B₁M₂毒素的毒性最强。

试剂

(1)丙酮－水溶液(85∶15)。

(2)氯仿－乙腈－异丙醇(93∶5∶2)。

(3)氧化铝：酸化，80～200目，110℃活化2小时，加3%水，搅拌均匀过夜。

(4)硅胶G：100～200目，110℃烘2小时，置干燥器中保存。

(5)脱脂棉：用氯仿洗涤、密封保存。

(6)硅藻土。

(7)硫酸胺。

仪器设备

(1)微柱制备：取10支微柱，规格为4×200mm，先在底部置少许脱脂棉，然后加1．5cm高的氧化铝，9cm高的干硅胶G，再加少许脱脂棉，轻敲填实，使无空隙和裂缝，可将10支一次制备完，置干燥器中备用。

(2)紫外灯。

(3)高速组织捣碎机。

操作步骤

1．样品提取：称取粉碎的谷物50克，置高速组织捣碎机中，加硅藻土10克和丙酮－水溶液150毫升，高速捣碎3分钟。过滤，取滤液50毫升置250毫升烧杯中，加饱和硫酸铵溶液2毫升0，水130毫升，硅藻土10克，搅拌，静置2分钟，过滤。取滤液100毫升置125毫升分液漏斗中，加苯3毫升，振摇30秒，弃去下面水层，再慢慢加水50毫升于苯层中，待分层后，弃去下面水层。将苯移至小瓶中，加无水硫酸钠澄清。

2．微柱层析：将苯浸提液由微柱底部进注，使前沿到氧化铝层约1cm处，将柱外表拭净，立即加入5毫升氯仿－乙腈－异丙醇溶液(展开溶剂)展开5分钟。在紫外灯下观察，如受黄曲霉素污染，则在氧化铝层显示蓝紫色荧光环带。呈显着蓝紫色荧光表示污染程度约10微克／千克(即每千克样品中含10微克黄曲霉毒素)。颜色呈现愈强，则表明超过此污染水平。样品如无污染则呈现浅白色或灰色而无蓝紫色荧光环带。

方法二：适用于每公斤样品中黄曲霉毒素的含量在5微克以上。

试剂

(1)弗罗里土：100～200目，110℃活化2小时。

(2)硅胶G：105℃活化1小时，加1%水，密闭，充分摇匀，保存15小时。

(3)氧化铝：中性，80～200目，110℃活化2小时。

(4)砂：须用水洗。

(5)胶体的制备：将电极置于盛有水100毫升和15%FeC1_。6H₂O溶液10毫升的烧杯内，加4%氢氧化钠溶液约14～16毫升，至pH4．6。如pH超过此值，则重新制备。

电极表面附着的铁胶用0．1N盐酸清除下来，备用。

操作步骤

1．样品提取：称取50克粉碎谷物，加250毫升丙酮－水溶液(85∶15)，用电磁搅拌30分钟，过滤、取滤液90m1，置于上述制备的含有铁胶的烧杯内。搅拌1～2分钟，再过滤，如滤液不清，可重复回滤。取滤液175～180毫升，置于500毫升分液漏斗中，加适量水，用氯仿50毫升浸取约1分钟，然后放出氯仿层，置于250毫升烧杯内。于水浴中浓缩至恰好干燥。用2毫升氯仿－丙酮溶液(9∶1)溶解残留物(相当于15克样品)于小瓶内，再用氯仿－丙酮溶液(9∶1)洗残留物二次，每次2毫升，洗液合并于小瓶内，冷冻保存。

2．微柱层析

(1)取3×250mm的微柱，按顺序加入玻璃棉、填塞5～7mm的砂，5～7mm的弗罗里土，2．0cm的硅胶和1．0～1．5cm氧化铝。

(2)吸取浸提液1毫升(相当于2．5克样品)注进微柱中，然后再放出。加约1毫升氯仿－丙酮溶液(9∶1)装满柱，也放出。

(3)在紫外灯下观察，如在弗罗里土层呈现蓝紫色荧光环带，则黄曲霉毒素含量大于5微克／千克(即每千克样品含黄曲霉素5微克以上)。环带如呈现在硅胶与弗罗里土层，则每千克样品中含黄曲霉毒素20微克以上(即大于20微毫／千克)。