维生素B1的测定方法

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第246页（10109字）

一、名称

化学名：氯化3－[(4－氨基－2－甲基－5－嘧啶基)甲基]－5－(2－羟基乙基)－4－甲基－噻唑鎓盐酸盐；3－[(4－amino－2－methy－5－pyrimi dinyl)methyl]－5－(2－hydroxy-ethyl)－4－methylthiazolechlor ide monohydrochloride

别名：硫胺素盐酸盐；维生素B₁盐酸盐

结构式：

分子式：C₁₂H₁₇CIN₄OSHCl

相对分子质量：337．27

化学名：硫胺硝酸盐(Thiamine mononitrate)

别名：维生素B₁硝酸盐

结构式：

分子式：C₁₂H₁₇N₅O₄S

相对分子质量：327．36

化学名：硫胺十六(烷)硫酸(Thiamine Dicetylsulfate)

别名：维生素B₁十六(烷)硫酸盐

结构式：

分子式：C₄₄H₈₄N₄O₉S₃·H₂O

相对分子质量：927．39

化学名：硫胺硫氰酸(Thiamine Thiocyanate)

别名：维生素B₁硫氰酸盐

结构式：

分子式：C₁₃H₁₇N₅OS₂·H₂O

相对分子质量：341．46

化学名：硫胺萘－1，5顺式二磺酸盐(Thiamine Naphthalene－1，5－disulfonate)

别名：维生素B₁萘－1，5－顺式二磺酸盐

结构式：

分子式：C₂₂H₂₄N₄O₇S₃·H₂O

相对分子质量：570．67

化学名：硫胺萘－2，6－顺式二磺酸盐

别名：维生素B₁萘－2，6－顺二磺酸盐

结构式：

分子式：C₃₄H₄₀N₈O₈S₄·4H₂O

相对分子质量：889．06

化学名：硫胺酚酞盐(Thiamin phenolphthalinate)

别名：维生素B₁酚酞盐

结构式：

分子式：C₃₂H₃₂N₄O₅S·3H₂O

相对分子质量：638．75

化学名：硫胺十二烷硫酸盐(Thiamina Dilauryl Sulfate)

别名：维生素B₁十二烷硫酸盐

结构式：

分子式：C₃₆H₆₈N₄O₉S₃·H₂O

相对分子质量：815．17

二、维生素B₁(盐酸盐)的鉴别

1．试剂和溶液

1．1 正丁醇。

1．2 二氧化锰。

1．3 硫酸。

1．4 氢氧化钠溶液 取氢氧化钠适量，制成40g／L溶液。

1．5 铁氰化钾溶液 取铁氰化钾适量，制成100g／L溶液。

1．6 淀粉指示液 取可溶性淀粉适量，制成5g／L溶液。

1．7 碘化钾淀粉试纸 取滤纸条浸入含有碘化钾0．5g的新制的淀粉指示液100mL中，湿透后，取出干燥，即得。

2．操作步骤

2．1 称取样品约5mg，加氢氧化钠溶液2．5mL溶解后，加铁氰化钾溶液0．5mL与正丁醇5mL，剧烈振摇2min，放置使分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光。加酸使成酸性，荧光即消失；再加碱使成碱性，荧光又显出。

2．2 本品的水溶液呈氯化物的鉴别反应。称取样品0．5g，置干燥管中，加二氧化锰0．5g，混匀，加硫酸湿润缓缓加热，即产生氯气。能使湿润的碘化钾淀粉试纸显蓝色。

三、维生素B₁盐酸盐含量的测定

(一)重量法(仲裁法)

1．试剂和溶液

1．1 盐酸。

1．2 丙酮。

1．3 硅钨酸溶液：取硅钨酸适量，制成100g／L溶液。

1．4 盐酸溶液：取盐酸适量，制成溶液(1→20)。

2．测定方法

称取样品0．05g(准确至0．0002g)，加水50mL溶解后，加盐酸2mL，煮沸，立即滴加硅钨酸溶液4mL，继续煮沸2min，用80℃恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀，先用煮沸的盐酸溶液20mL分次洗涤，再用水10mL洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5mL，在80℃干燥至恒重，精密标定。

3．分析结果的表述

维生素B₁(盐酸硫胺)含量以质量分数(w)表示，按式(9－49)计算：

式中 m₁——干燥后沉淀的质量，g

m₂——样品质量，g

w₁——样品干燥失重，%

0．1939——盐酸硫胺硅钨酸盐换算成盐酸硫胺的因素

所得结果应表示至1位小数。

4．允许差

本方法平行测定的允许相对差在0．5%以内。

(二)非水滴定法

1．试剂和溶液

1．1 冰乙酸。

1．2 乙酸汞溶液 取乙酸汞适量，制成5%(质量分数)溶液；

1．3 高氯酸标准滴定溶液 取高氯酸适量，制成0．1mol／L溶液。

1．4 喹哪啶红－亚甲蓝混合指示液 喹哪啶红0．3g，亚甲蓝0．1g，加甲醇至100mL。

2．测定方法

取本品约160mg(准确至0．0002g)，加冰乙酸20mL，微热溶解，冷至室温，加5%乙酸汞溶液5mL，喹哪啶红－亚甲蓝混合指示液2滴，以高氯酸标准滴定溶液(0．1mol／L)滴定至天蓝色，强烈振摇，0．5min不褪色即为终点。并将滴定的结果用空白试验校正。

3．分析结果的表述

维生素B₁(盐酸硫胺)含量以质量分数(w)表示，按式(9－50)计算：

式中 V——样品消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mL

V₀——空白试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积，mL

c——高氯酸标准滴定溶液的实际浓度，mol／L

m₃——样品质量，g

x——干燥失重，%

0．1686——与1．00mL高氯酸标准溶液〔c(HClO₄)=1．00mol／L〕相当的维生素B₁的质量，g

所得结果应表示至1位小数。

4．允许差

本方法两次平行测定的允许相对差在0．3%以内。

四、食品中维生素B₁的测定方法

(一)荧光法

1．原理

维生素B₁又名硫胺素、抗神经炎素。硫胺素在碱性高铁氰化钾溶液中，能被氧化成一种蓝色荧光物质——硫色素(Thiochrome)。在紫外光下，硫色素发出荧光。在标准条件和没有其他物质存在的情况下，荧光强度与硫色素的浓度成正比。反应式如下：

如样品中所含杂质较多，可用柱层析法处理，使硫胺素与杂质分开，然后洗脱，测定提纯溶液中硫胺素含量。硫胺素能溶于丁醇，其在丁醇中较在水溶液中更为稳定。

2．试剂和溶液

2．1 硫胺素标准贮备液(0．1mg／mL) 将硫胺素(粉状结晶)置于氯化钙干燥器中24h。精确称取干燥的硫胺素100mg(准确至±0．0002g)，溶于0．01mol／LHCl溶液中，稀释至1000mL，贮于棕色瓶中(放冰箱内可保存2～3个月)。

2．2 10μg／mL硫胺素标准中间液 取贮备液10mL，用0．01mol／LHCl稀释至100mL(冷藏可保存1周)。

2．3 0．1μg／mL硫胺素标准使用液 吸取中间液1．0mL，用冰稀释至100mL，同时用水醋酸调至pH4．5(用时现配)。

2．4 1%铁氰化钾溶液 1g铁氰化钾溶解于水，稀释至100mL，置于棕色瓶，避光冷藏。

2．5 碱性铁氰化钾溶液 吸取1mL1%铁氰化钾溶液，以15%氢氧化钠稀释至15mL。此溶液需新鲜配制，并避免阳光照射。

2．6 15%氢氧化钠溶液。

2．7 2．5mol／LCH₃COONa溶液 205g无水醋酸钠或345g含水醋酸钠用水溶解并稀释至1000mL。

2．8 淀粉酶溶液 取淀粉酶制剂配成2%水溶液或用2．5mol／LCH₃COONa溶液配成酶悬浮液(当日现配)。

2．9 25%氯化钾溶液 取250g氯化钾溶解于水，并稀释至1000mL。

2．10 25%酸性氯化钾溶液 取8．5mL浓盐酸，用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。

2．11 0．1mg／mL硫酸奎宁贮备液 取100mg硫酸奎宁溶于0．1mol／L(H₂SO₄)中，并稀释至1000mL。放入棕色瓶，保存于冰箱，若溶液变浑浊，应重配。

2．12 0．15μg／mL硫酸奎宁应用液 取1．5mL硫酸奎宁贮备液以0．1mol／L(H₂SO₄)稀释至1000mL。

2．13 异丙醇无水。

2．14 0．04%溴甲酚绿指示剂溶液 称取0．1g溴甲酚绿，吸取0．05mol／LNaOH溶液2．9mL，使其溶解，然后用水洗入25mL容量瓶中，即得浓度为0．4%溶液，再用水稀释10倍，成为0．04%溴甲酚绿指示剂溶液。

2．15 0．05mol／LNaOH溶液。

2．16 0．1mol／L(1／2H₂SO₄)溶液。

2．17 活性人造沸石(30～60目筛) 活化方法：取100g人造沸石，以10倍于其体积的3%热醋酸搅拌2次，每次10min，静置，倒出上清液，再用5倍体积的25%热氯化钾搅拌15min，静置倾去溶液，再用3%热的醋酸搅拌10min，静置倒出液体，然后用热蒸馏水洗至无氯离子为止，放布氏漏斗中抽干，100℃以下烘干，保存在密封的广口瓶中。

3．仪器

荧光计。

4．测定方法

4．1 提取 称取一定量磨细样品(维生素B₁含量在10～30μg之间)，放入250mL锥形瓶中，加入75mL0．1mol／LHCl溶液，在沸水浴上或压力锅中加热30min，经常摇动，使样品均匀。

用醋酸钠溶液调节提取液的pH至4．5(用溴甲酚绿做指示剂)。提取液冷却至室温，为了使结合性硫胺素游离出来，加入淀粉酶(粮谷类试样可不加淀粉酶，鱼肉类每克加酶20mg，新鲜果蔬每克加酶3mg)，在37℃下保温过夜(为防止杂菌生长，在液面上盖一层甲苯)，或在45～50℃保温3h。提取液冷却至室温，用水稀释至100mL，混匀后过滤，弃去最初的几毫升溶液。

4．2 纯化 在盐基交换管下端装以玻璃棉或脱脂棉少许，将1．5g人造沸石先用蒸馏水浸泡，搅拌除去气泡后装入盐基交换管中，体积约占管长的1／3(在装管时以及以后的吸附洗脱操作中，液面不能降到沸石层表面以下，否则影响效果)，用蒸馏水洗涤，弃去洗液。

吸取25mL提以液，加到已准备好的盐基交换管中，提取液通过沸石的速度为60滴／min左右，弃去滤液。

用热水洗涤盐基交换管3次，每次大约用10mL，弃去洗液。

用约10mL热酸性氯化钾洗脱，待完全流下，但液面恰未下降到沸石层表面时，再加10mL。收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾液稀释至刻度。

取25mL维生素B₁标准应用液(0．1μg／mL)，加入另一准备好的盐基交换管中，按上法用热水洗涤，用热酸性氯化钾洗脱收集。

4．3 氧化和萃取 取两个25mL带塞比色管，标明“测定”及“空白”。各准确加入5mL已净化的提取液。在“测定”管内加入3mL碱性铁氰化钾液，在“空白”管内加入3mL15%氢氧化钠溶液。摇匀。两管内各准确加入10mL异丙醇，并剧烈振摇90s。

用标准维生素B₁滤去液代替样品提取液，重复上述氧化、萃取操作。数分钟后，有机相与水相即清楚分离开，这时用长的吸管或滴管从比色管底部将水相全部吸出并弃去。

4．4 测定 首先在仪器第一滤光片位置上装上360nm滤光片，在第二滤光片位置上装420nm或450nm滤光片，再打开总开关。15min后将仪器灵敏度倍率转换开到第Ⅲ档×100(3)，用0．15μg／mL硫酸奎宁溶液调整仪器指针读数为50，分别测定样品、标样的“空白”管和“测定”管的荧光强度。

5．分析结果的表述

式中 E₁——样品管荧光读数

E₂——样品空白管荧光读数

E₃——标准管荧光读数

E₄——标准空白管荧光读数

ρ——标准溶液浓度，μg／mL

V₁——过柱体积，mL

V₂——稀释的体积，mL

m——样品质量，g

注：硫胺硝酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×0．971

硫胺十六烷硫酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×2．75

硫胺硫氰酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×1．01

硫胺萘－1，5－顺式二磺酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×1．69

硫胺萘－2，6－顺式二磺酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×1．32

硫胺酚酞盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×1．89

硫胺十二烷硫酸盐含量(mg／100g)=硫胺盐酸盐含量(mg／100g)×2．42

由各硫胺盐类换算成硫胺盐酸盐的系数如下：

硫胺硝酸盐：1．0303

硫胺十六烷硫酸盐：0．3637

硫胺硫氰酸盐：0．9878

硫胺萘－1，5－顺式二磺酸盐：0．5910

硫胺萘－2，6－顺式二磺酸盐：0．7588

硫胺酚酞盐：0．5280

硫胺十二烷硫酸盐：0．4137

(二)重氮比色法

1．试剂和溶液

除(一)中所用试剂外，还有以下试剂。

1．1 异丁醇 (特级)经检查不含荧光物质。

1．2 4mol／LCH₃COONa溶液 称取544g乙酸钠，加水溶解后稀释至1000mL。

1．3 溴化氢溶液 向100mL冷水中加溴水2mL，激烈振摇，混合后滴加冰冷的(1→10)硫氰酸钾溶液至恰到溴素脱色止。此溶液在通气橱中配制，冷处保存(1个月内有效)。

1．4 溴水 特级。

1．5 甲苯 特级。

1．6 硫氰酸钾 特级。

1．7 无水硫酸钠 特级，经检查无荧光。

2．测定液的制备

2．1 铁氰化钾法 按(一)中的提取、纯化步骤制备样品溶液，吸取样品溶液各5mL，分别加到A、B、C3支具塞比色管中。向A管中准确加入1mL标准液，向B、C管中各加1mL水，然后在A、B管中各加0．5mL(1→100)铁氰化钾溶液，C管中加0．5mL水充分振摇混合。再分别向A、B、C管中各加3mL(3→10)氢氧化钠溶液，振摇30s。然后准确各加入10mL异丁醇，密塞，激烈振摇2min，静置分层，用吸管吸取异丁醇层液体各7～8mL，分别放入另外比色管中，各加2g无水硫酸钠(每次少量加入)振摇，静置至异丁醇层澄清，作为测定液。

2．2 溴化氰法 准确吸收(一)中处理好的样品溶液各5mL，分别加入3支具塞比色管中，A管中加1mL标准液。B、C管中，各加1mL水，再向A、B管中各加3mL溴化氰溶液，C管加3mL(3→10)氢氧化钠，充分振摇后，向A、B管中各加3mL(3→10)氢氧化钠，向C管中加3mL溴化氰，充分振摇后再各准确加入异丁醇10mL，密塞，激烈振摇1min，静置分层，然后用吸管吸取异丁醇层溶液各7→8mL，分别加到其他比色管中，各加2g无水硫酸钠(每次少量加入)。振摇混合，静置至异丁醇层澄清，此液作为测定液。

3．测定

向测定液中(含硫胺盐酸盐10～20μg)加入酸性白土，使硫胺被酸性白土所吸附。水洗后加酚溶液，重氮化的对氨基苯乙酮溶液及碱，使其偶合，然后分取酸性白土，进一步把红色色素转溶于二甲苯中，在波长520nm处测定吸光度。此法也是利用硫胺的特异反应，但没有硫胺荧生成反应灵敏。但比硫胺荧荧光法操作简单，适用于硫胺含量高的食品。