神经生长因子

出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第560页（27344字）

一、神经生长因子

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是最早发现的细胞生长调节因子，也是迄今为止研究得最清楚的一个神经营养因子。NGF在神经元的发育、轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用。它促进发育中的交感、感觉神经元的分化和成熟，维持成年交感神经元的正常功能。近年的研究表明，成年感觉神经元也需要NGF的营养支持。中枢神经系统的基底前脑胆碱能神经元和纹状体的胆碱能中间神经元的发育、分化也受到NGF的调节。动物实验表明，NGF有临床应用的潜在价值。一些神经元退行性疾病，如Alzheimer’s Disease和Huntington’s Chorea等的发生和发展可能与缺乏NGF的营养作用有关。NGF对中枢和周围神经的损伤也有保护和恢复的作用。尤其，NGF能促进神经细胞的再生。在某些神经系统损伤时，多次给予NGF可减轻和改善对神经元的伤害。除神经作用外，NGF的非神经作用也日益引起人们的关注。免疫系统的肥大细胞、巨噬细胞和胸腺细胞的功能也受到NGF的影响。作为多态因子网络中的一员，NGF在炎症反应，组织损伤后的修复，促进伤口愈合及急性迟发型超敏反应中发挥重要作用。研究表明，NGF对肿瘤具有治疗作用。NGF及其受体在某些神经系统肿瘤中常高浓度地表达。NGF的来源十分广泛，不同来源的NGF具有相似的生物学活性。由于对NGF的研究不仅具有重要的理论意义，还具有广泛的应用价值，所以日益受到重视，已成为神经科学最活跃的领域之一。

(一)NGF的结构

经典的NGF是从小鼠颌下腺中分离所得的分子量为140000的糖蛋白，由α、β、γ3种肽链按α₂γβ₂的比例构成，肽链间以共价键结合。其中β亚单位是NGF的活性区。经过40多年的研究，NGF的蛋白结构已基本了解清楚，三维结构已从其晶体图像证实。它由两个相同的亚单位组成，亚单位由三个β转角连接的3对反平行β折叠组成。亚单位间通过“半胱氨酸结点”连接。目前发现的NGF均为糖蛋白，其构型至关重要的氨基酸在神经营养素家族中保守，不同NGF的特性由可变区的氨基酸决定，可变区的变化不影响它们的基本结构，但对特异性受体的结合起决定作用。NGF单体保守结构主要包括两对反向平行的β链，β链构成了NGF长而扁平的形状，其中包括6个半胱氨酸残基，组成3对二硫键。这3对二硫键为组成NGF的结构提供刚性支持，其中的两对及其相连的残基形成了一个环状结构：(Cys⁵⁸－Cys¹⁰⁸，Cys⁶⁸－Cys¹¹⁰)；第三对(Cys¹⁵－Cys⁸⁰)穿过此环形成紧密包裹的“半胱氨酸结”。这种结构使得两个NGF单体中的β链互相包裹，组成一个较大的由芳香族氨基酸残基构成的疏水单体交界面，沿着两个单体平面的轴形成了NGF二聚体的活性分子。组成疏水面的氨基酸残基对NGF三维结构的形成起了主要作用，还有一些氨基酸残基通过氢键和盐键，辅助支持三维结构的稳定性。当与高亲和力受体结合时，保守结构，尤其是β₃ β₄链对形成配体－受体复合物起到支持作用，因为这种结合需在NGF二聚体的疏水面上进行。

(二)NGF的构效关系

NGF结构中位于转角Ⅰ区和Ⅴ区的正电荷区参与P75的结合，该区域由至少3个带电荷的赖氨酸残基组成。NGF与TrkA的结合需要至少NGF分子中5个不同区域参与，结合的位点分布于NGF的二聚体，并集中在NGF二聚体一边。整个结合位点呈一平面并与NGF的二重旋转轴基本平行。由于NGF二聚体呈二重旋转轴对称，NGF有两个TrkA的结合位点，有利于TrkA受体二聚体的形成。

(三)NGF的来源

长期的研究表明，NGF的来源十分广泛。经典的NGF是从小鼠颌下腺中分离所得。Angeletti等从印度眼镜蛇中分离、纯化了NGF，并测定了这种NGF的氨基酸组成及顺序。Server等比较了印度眼镜蛇蛇毒的NGF与小鼠颌下腺NGF的结构和功能。蛇毒是NGF的重要来源之一。我国的蛇毒资源丰富，蛇毒液中富含NGF的3种毒蛇(Crotalidas、Viperidae、Elapidae)在我国都有相应的蛇种。在外周神经中，NGF主要分布在颌下腺、心脏、虹膜、皮肤、坐骨神经及输精管等有交感神经或感觉神经支配的组织。此外，NGF在肾上腺、睾丸、肝及骨骼肌等组织也有少量分布。这些组织中NGF mRNA的含量往往与交感神经在该组织的分布密度呈正相关。即交感神经分布密度越大，靶组织中NGF mRNA的含量越高。在中枢神经系统中，NGF主要分布于海马、大脑皮层、中隔、Broca斜角带、迈内特氏核、嗅球及纹状体中间神经元的胆碱能神经元。NGF mRNA则存在于上述神经元所支配的区域，其中海马齿状回的颗粒细胞层及CA1～CA3区的锥体细胞层以及大脑皮层中含量最高。在这些组织中，靶区NGF mRNA的含量往往与胆碱能神经在该组织中的分布密度呈正相关。最近，有报道从不同动物的不同组织、器官及人的体液，如唾液、血清、尿液等中分离、纯化出NGF。这些研究表明NGF可以由不同来源的细胞分泌，而不仅仅由神经细胞分泌。

(四)NGF的受体

NGF的受体蛋白有两种。一种是高亲和性NGF受体，在结合的动力上是慢的。NGF的高亲和性受体是由原癌基因trk编码的一种酪氨酸蛋白激酶受体，称TrkA。NGF和TrkA结合可出现细胞学反应，包括增强细胞的存活和生长。Trk受体的信号转导机制与其他酪氨酸蛋白激酶受体的相似。NGF激活TrkA受体，进而引起细胞内信号传递的一系列过程。这类分子一般分两步被激活，首先，NGF与其相应受体的细胞外部分结合后，先引起受体分子在细胞表面发生二聚体化，然后受体细胞内结构上酪氨酸激酶活性被激活，使受体自身结构中酪氨酸残基发生自身磷酸化。

TrkA的起始底物是TrkA分子本身。在TrkA二聚体内，每一个TrkA亚基催化其他亚基磷酸化。磷酸化部位包括位于激酶结构域的3个酪氨酸及在此结构域外的两个酪氨酸。在激酶结构域内的酪氨酸先发生磷化并增强酪氨酸激酶的活性，继而在激酶结构域外的酪氨酸又被磷酸化。这样，酪氨酸磷酸化的TrkA便成为吸收各种连接蛋白质和酶的支架，最终传播NGF信号。

与酪氨酸磷酸化的TrkA相互作用的蛋白质是磷酯酶C(PLC)和PI3激酶及连接蛋白质Shc。以Shc或PLC起始的Ras2MAP激酶途径可能与细胞分化有关，该途径的主要功能是通过调节基因的表达而诱导细胞分化，对NGF诱导PC12细胞分化是重要的。而PI3激酶途径则可能对细胞存活是重要的。PI3激酶能介导NGF对细胞存活的效应，PI3激酶抑制物能促进PC12细胞在有NGF存在下的细胞凋亡。

另一种NGF的受体蛋白是低亲和性NGF受体，简称P75。在结合动力学上，它能很快与配体结合，但NGF与它结合一般不出现可察觉的细胞学反应。P75是糖蛋白，主要在对NGF起反应的细胞上表达，与细胞凋亡和细胞迁移有关。P75可以作为一种副因子调整Trk受体对NGF的反应。最近的研究指出P75能与NGF受体起明显的功能性相互作用，能允许Trk受体对较低浓度的NGF起反应。由于体内NGF的量很有限，P75这种加强功能可起一定的重要作用。另外，有报道单独P75本身亦能起信号作用。但迄今为止，尚未有证据证明神经元能在无Trk受体存在下对NGF起反应。

(五)NGF的神经生物学活性

NGF能支持神经元存活，促进其生长、分化，维持其功能。对NGF起反应的神经元主要有交感神经元、某些感觉神经元和中枢胆碱能神经元。NGF由这些神经元的靶组织产生，被神经元的轴突末梢摄取，藉逆运行运输到胞体，为这些神经元的存活和维持所必需。所以，NGF是典型的靶源性神经营养因子。

在外周NGF对肾上腺素能神经及初级神经元有作用。它可引起这些神经元的分化、神经突起的生长、激活儿茶酚胺合成酶及神经肽合成酶的生成。外周的NGF主要在非神经组织合成，它的合成与释放和神经元的活动无关。在中枢神经系统中，NGF对单胺类能神经元并无作用，而是对某些胆碱能神经元有作用。外源性NGF可引起这类神经元增生和延长存活时间。NGF mRNA存在于胆碱能神经所支配的区域，生成的NGF可被这些神经末梢摄取，通过逆向运输到达胞体，对胆碱能神经元起营养作用。近年研究表明在中枢神经系统中，有关的神经元除了有基础水平的NGF合成与释放外，NGF的合成及释放受到神经元活动的调节，而NGF本身又可使具相应受体的神经元递质释放增加，提示NGF可能作为一种选择性的逆向传递信使分子参与神经突触功能的调节作用。

NGF对周围神经系统的感觉神经元和交感神经元及中枢神经元的存活均有支持作用。①感觉神经元：NGF能深刻影响脊椎动物神经系统的发育。NGF具靶源性存活因子的作用，多数感觉神经元在早期轴突生长时期不需要NGF，但当轴突抵达靶时则需要NGF维持其存活。成年动物的感觉神经元在生理和解剖上都是异性成分，NGF只支持感受伤害的感觉神经元的存活。②交感神经元：交感神经元的发育需要NGF。所有依赖NGF的神经元在发育过程中都是先有一个依赖神经营养素－3的时期。成年交感神经元仍需NGF维持其存活，但不需要来自外周的NGF维持其存活。③中枢神经元：NGF支持基底前脑胆碱能神经元的存活。啮齿类大部分基底前脑胆碱能神经元发育时期的存活并不绝对依赖NGF，但成年时期需要NGF维持其胆碱能表型及终末视野大小。

发育时期NGF的水平改变不会影响神经元的细胞数目，但会改变其表型。NGF也调节已分化的表型。作为感觉神经元递质或调质的神经肽，其水平受NGF效率的调节。

NGF作为一个重要化学物质参与组织损伤时感觉神经元功能改变引起疼痛的环节。用NGF抗体可防止组织炎症后正常发生的热和机械性痛觉过敏。NGF也能防止因切断交感神经元节前纤维而导致的功能性突触连接的丧失。在视觉系统，视皮质的眼优势是依赖各类丘脑传入活动建立的。在视皮质中的NGF能稳定丘脑传入的突触接触。外源性的NGF可稳定原来的突触接触和防止突触可塑性变化。

NGF不仅能支持原代培养的感觉神经元的存活，还能促进它们突起的生长。切断大鼠坐骨神经，在其远侧段可观察到NGFmRNA水平显着上调。感受伤害的传入终末在其靶区内的侧枝出芽需要NGF，但神经生长并不依赖NGF。

NGF研究的迅速发展导致探讨将其应用于临床治疗的可能性。首先要有足量纯化的NGF。多年以来对NGF来源进行了大量的研究，开发出许多NGF的来源和分离、纯化途径。从神经组织到小鼠下颌下腺、蛇毒等，及至不同动物的不同组织、器官及人的体液等中分离、纯化出NGF，但含量均相对较低，难以满足研究和临床应用。直到近年来，蛋白质化学、分子生物学、分子遗传学等相关学科迅速发展，人工重组NGF的问世，才基本解决了此问题。不同来源的NGF具有相似的生物学活性，但它们的物理化学特性及免疫学性质存在较大的差异，这部分是由于连接的糖链不同的原因。经过多年的研究，NGF的蛋白结构已基本了解清楚，其三维结构也已从其晶体图像证实。但对其构效关系，糖链的作用等问题依然没有令人信服的答案。因此对不同来源NGF的研究也依然在进行中。

(六)NGF在中枢神经系统损伤中的应用

以往认为中枢神经系统损伤后不能再生，现在发现哺乳动物中枢神经元本身具有再生潜力，在适当条件下，能发生轴突侧枝出芽和突触重建。中枢神经系统损伤后尽管神经元本身能产生微量的内源性NGF，然而，损伤部位大量的神经元相互竞争NGF，那些不能获得足够NGF的神经元即发生死亡。因此如何提供合适的微环境来促进中枢神经系统修复成为目前研究的重点。目前的方法有：①将NGF灌注入神经元：直接的途径是将纯化的NGF直接注入神经细胞，或是将NGF与具有缓解功能的多聚体或微粒结合后植入，使受损部位在一定时期内具有NGF的生物效应；载体介导通过血－脑屏障是NGF灌注的间接方法：将NGF及其抗体与转铁蛋白结合，由于中枢神经系统血管壁富含转铁蛋白受体，所以该技术可将NGF更多地聚集于中枢神经系统。②NGF生成细胞的移植：即将正常情况下能合成NGF的细胞或经过基因修饰能合成或分泌大量NGF的细胞移植于受损的中枢神经系统中。③NGF的基因治疗：随着NGF基因克隆的成功和转基因技术的出现，NGF基因治疗已成为可能。NGF基因导入方法包括：一是在体外将NGF基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源性NGF基因的细胞在体内表达，从而达到治疗的目的。Tuszynski等将NGF基因导入培养的雪旺氏细胞内，再将其移植入大鼠脊髓，雪旺氏细胞在体内稳定地表达NGF并促进轴突再生。另一种方法是将外源基因直接导入体内有关组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。

二、脑源性神经营养因子

脑源性神经营养因子(BDNF)作为神经营养因子家族中的一员，广泛分布于大脑中，是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等的存活和生长发育并能防止它们受损死亡，改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物效应的多肽或蛋白质，在中枢神经系统(CNS)的损伤修复中具有重要的作用。

(一)BDNF的理化性质

分子量及分子结构：BDNF是Barde等1982年从猪脑中分离纯化的一种碱性蛋白，分子量为12．3kD，等电点为10，因其来源于脑组织，并可维持鸡胚感觉神经元的体外存活、促使其神经元出芽而被命名。由1．5kg的猪脑中可提取该因子1mg，其生物活力为0．4ng／ml unit。BDNF有两种不同的前体形式，分别是长链和短链前体，目前已知短链前体由249个氨基酸组成。1989年，Leibroch等人用鼠cDNA探针和Northem Blot方法分析发现，脑内存在着BDNF的mRNA，证实了中枢神经可以合成BDNF；同时发现BDNF与已知的神经生长因子(NGF)结构上有着极其相似的氨基酸序列及相互关联的生物学活性，表现为二者的肽链均由大约120个氨基酸组成(约有55%～60%的氨基酸同源序列)，其中的6个恒定的半胱氨酸残基可形成维持BDNF、NGF生物活性所必需的3对二硫键。由此提出，BDNF与NGF同为一个基因家族，并与后来以PCR技术鉴定克隆出的NT₂3、NT₂4和NT₂5一起被统称为“神经营养素家族”。以T₂载体克隆法对人BDNF全长基因PCR产物克隆及基因序列分析显示，人BDNF基因全长共744bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。BDNF所诱导的突触增强作用由cAMP介导的门控系统来调节。

(二)BDNF在脊髓的分布

与NTFs家族其他成员一样，BDNF也可在不同组织中表达。但是，BDNF的表达主要局限在CNS。BDNF mRNA在正常SC的表达水平从胚胎到成年期逐渐下降，以至成年时几乎不能检测到BDNF mRNA的存在。提示BDNF可能与胚胎SC的发育有密切关系。相较之，BDNF蛋白在成年SC中仍具相当的表达水平。在成年期，BDNF主要分布在SC灰质，特别是腹角运动神经元；另外，轴索和胶质细胞亦有BDNF表达。这些胶质细胞包括少突胶质细胞、少数星形胶质细胞和小胶质细胞P巨噬细胞亚群。BDNF在正常SC的分布提示其在维持SC的正常发育中起重要作用。

(三)BDNF及受体

脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一员，具有支持体外培养鸡胚感觉神经元的存活和突起生长的作用，主要分布于脑，在心、肺和脊髓运动神经元的外周靶组织也有一定的分布。切断大鼠坐骨神经后可导致受损神经远侧端BDNF mRNA表达增加，其增高水平为神经生长因子(NGF)mRNA的10倍；其时空表达模式也与NGF mRNA有所不同。在神经损伤后3天BDNF mRNA开始缓慢增加，至3～4周达到最高峰。研究显示，外周神经损伤时，BDNF主要来源于外周神经的雪旺氏细胞或靶组织的肥大细胞。

BDNF受体分为低亲和性受体和高亲和性受体。低亲和性受体为P75，是富含酪氨酸的糖蛋白，不具备酪氨酸激酶活性。高亲和性受体为酪氨酸激酶受体P145，即TrkB。TrkB也是NT₂4／5的受体，它有全长TrkB受体和截短TrkB受体之分。截短受体有细胞外配体结合区和很短的胞内区，又可分为TrkBT₁、TrkBT₂，它们在细胞内各含有2321个氨基酸，都能介导BDNF的信号转导，并使细胞内核酸代谢产物增多，在细胞信息通路中发挥生理效应。正常成年和早期发育大鼠腰骶段脊髓内BDNF mRNA在脊髓运动神经元中均有表达。TrkB主要分布在脊髓腹角运动神经元，中间带及背角部分细胞亦有表达。胶质细胞中同时有BDNF蛋白及mRNA、TrkB的表达。提示脊髓各型神经元，不仅是BDNF的效应细胞，其自身亦表达BDNF。靶源性、自分泌和旁分泌产生的BDNF共同参与了脊髓神经元的调节。BDNF与支配神经元轴突末梢膜上的受体结合后，逆行运输至胞体产生生物效应。BDNF也可以经胞体顺行运输至轴突末端并释放，被次级神经元所摄取和利用，参与突触可塑性。

(四)BDNF的生物学作用

BDNF对周围和中枢神经元有广泛的作用。BDNF与受体结合后能促进背根节、三叉神经节、节状节、岩节及三叉神经中脑核等感觉神经元的存活和突起生长。BDNF能维持中脑多巴胺能神经元、基底前脑胆碱能神经元的存活、分化及功能表达。因此，BDNF对神经元损伤修复与再生起重要作用，具有广泛的临床使用价值。

(1)初级感觉神经元：在早期发育阶段，BDNF能使神经嵴细胞向感觉神经元谱系分化。神经元源性的BDNF对发育中的鸟类背根节感觉神经元有旁分泌作用且决定外周胶质的表型。BDNF可在成鼠背根节感觉神经元内合成，并通过自分泌、旁分泌的方式起作用。而神经元自分泌、旁分泌的神经营养因子可作用于未激活的神经母细胞，使之增殖、分化并在神经元存活与再生中发挥重要作用。最近，Michael等发现NGF可提高背根节内表达trkA的感觉神经元BDNF的合成，在神经轴突切断后可以提高感觉神经元BDNF的合成及顺行运输能力，因此BDNF被认为是一种由感觉神经元释放的顺行性营养信息因子来影响NGF和调节感受伤害信息的反应。BDNF和NT－3还支持前庭和听觉系统初级感觉神经元的存活。BDNF和NT－3基因敲除的动物，其前庭和螺旋神经节感觉神经元全部丧失。而前庭神经元大多依赖BDNF，大多螺旋神经元则依赖于NT－3。大鼠视神经切断后，用微泵供应BDNF，NT－4／5可刺激再生视网膜节细胞的轴突分支生长进入中枢靶位。BDNF也可促进体外睫状神经节及培养中视网膜节细胞的存活。

(2)运动神经元：BDNF在脊髓运动神经元中有一定的分布，并在神经损伤后保护运动神经元存活及在运动神经元纤维的再生中发挥作用。大多数运动神经元有BDNF、NT－3、TrkB及TrkC样免疫反应，提示脊髓运动神经元可以通过BDNF、NT－3进行自分泌或旁分泌调节。在成鼠脊髓腹根撕脱伤和新生鼠神经轴突切断后，外源性BDNF可以减少脊髓内运动神经元的死亡。鞘内注射BDNF可逆转运动神经元胞体的萎缩和乙酰胆碱转移酶活性的下降。在Wobbler小鼠模型中(运动神经元疾病)，外源性BDNF可以阻滞运动功能失调，并减少去神经支配的肌萎缩和运动神经元轴突的丢失。BDNF还能维持中脑多巴胺能神经元的存活和分化，保护胚胎多巴胺能神经元免受62羟基多巴胺(62－OH DA)和12甲基，42苯基吡啶(MPTP)的毒性作用，这与降低氧化物谷胱甘肽还原酶浓度有关。去除BDNF后，培养的脊髓运动神经元NO及超氧化物合成增加，可能与激发诱导运动神经元凋亡有关。Becker等认为BDNF、NT－3对培养中运动神经元存活有一定的剂量依赖关系，且TrkB受体可通过自动磷酸化与配体BDNF共价结合而激活细胞内信号转导途径。而在轴突切断后，脊髓内运动神经元TrkB mRNA表达增加。说明BDNF、NT－3有可能通过其受体而发挥存活与再生效应。

(五)BDNF与神经再生

大鼠面神经切断并给予外源性BDNF，于术后14天发现面神经功能开始恢复，与对照组比较，GAP243 mRNA表达增高的时间更短，面神经的再生明显地加快。坐骨神经切断后，通过渗透泵装置补充BDNF于受损部位，经过一段时间后可使再生神经轴突直径加大，髓鞘形成并变厚。这一作用在BDNF与CNTF合用后效果更明显。Cellerion等检测了BDNF敲除的转基因小鼠，发现神经轴突数目正常，而髓化的轴突在出生后20天与对照组比较明显减少，且表达髓鞘蛋白PLP，MBP mRNA也减少。McTigue等在大鼠脊髓撕脱伤后迅速移植入可分泌各种神经营养因子的成纤维细胞，在损伤后10周，各种移植体中均有轴突生长，其中含NT－3、BDNF组的移植体中含有更多的再生纤维，并有较多的髓鞘蛋白阳性产物。结果提示各种神经营养因子参与神经再生，其中NT－3、BDNF更有利于髓化纤维的再生，并可通过少突胶质细胞的增殖参与再生纤维的髓鞘化。Sawai等发现大鼠视神经切断后，玻璃体微量注射BDNF可使视神经轴突增长8倍，但节细胞轴突发出的新芽数并不增多。Watanabe等发现猫的不同类视网膜节细胞对视神经切断后的易感性不同，而BDNF、NT－4／5能有效地挽救细胞退行性死亡，并促进视网膜内视神经轴突的生长。在大鼠中胸段脊髓切断模型中，用BDNF、NT－3结合雪旺氏细胞移植发现BDNF、NT－3能促进脊髓固有束上行纤维的再生并有更多的髓化纤维存在。在成年大鼠脊髓运动神经元中BDNF发挥着一定的神经保护作用，能极强地挽救脊髓运动神经元退行性死亡。而BDNF长期效应更有利于运动神经轴突的再生。Mamounas等证实缓慢BDNF浸润可显着刺激大鼠脑内新皮质区、海马内受神经毒素PCA损伤的轴突发芽，并能持续到停药后5周。可见在神经损伤与再生中，BDNF有其独特的作用，但也依赖于多种因子的协调作用。

(六)BDNF促进神经再生的机制

Hughes等发现神经元的损伤常伴有神经元内快速、短暂的并呈活动依赖性的BDNF表达。损伤部位的神经元对伤害性刺激的反应之一就是细胞内mRNA的变化。Sobue等报道在轴突溃变病理过程中，p75NGFR mRNA、BDNF mRNA、NT－3mRNA有显着的上调表达，TrkB、TrkC mRNA表达则下降。BDNF、NT－3mRNA水平表达增高与受损神经组织中T细胞、巨噬细胞浸润程度成正比，和轴突的去髓鞘化无直接关联，提示炎症细胞浸润可能参与BDNF、NT－3mRNA的表达，从而发挥神经修复作用。BDNF对神经元保护、促进神经元存活与损伤后再生是一个复杂的生命过程，其机制如下：①BDNF调节细胞膜上钙离子通道蛋白的表达而影响钙离子流；也可能通过神经肽的表达来维持细胞内钙的稳态。②BDNF通过抗自由基损伤，提高细胞内抗氧化酶的活性及刺激细胞的修复。③BDNF通过转录因子等上游元件调节神经元内基因的表达，如c-fos、c-jun等，抑制细胞凋亡、坏死的发生。而这种效应可能是通过翻译后的机制诱导TrkB受体的表达增高来实现的。④神经营养因子促进表达正常神经元功能所必需的分子，并维持正常信号的传递。BDNF与TrkB结合后可启动细胞内信号转导途径如磷酸脂酶Cγ(PLC)、Ras-MAP激酶途径、PI3激酶途径等，从而产生相应分子对神经元起保护、促进再生作用。BDNF与TrkB受体结合后激活酪氨酸激酶，导致酪氨酸蛋白以及多种蛋白的磷酸化，如PLCγ、PI3－K等。PLCγ继而激活RAS-MAPK等途径，它与细胞的增殖分化有关；而PI3－K的激活则主要发挥促存活效应。

(七)BDNF在脊髓损伤后的表达变化

脊髓损伤后，BDNF及其mRNA的表达均较损伤前明显增加。Dougherty等发现，脊髓损伤后，损伤脊髓局部BDNF免疫反应阳性星形胶质细胞和小胶质细胞P巨噬细胞数显着增加。此外，脊髓损伤后1天和1周，大多数少突胶质细胞呈BDNF免疫反应阳性。Goto等亦发现，大鼠脊髓横切损伤后4周，灰质中BDNF免疫阳性星形胶质细胞明显增多。脊髓损伤后，BDNF及其mRNA在胶质细胞中的表达增加，可能与胶质细胞通过产生BDNF等NTFs，进而参与脊髓损伤修复有关。Ikeda等认为，脊髓损伤后早期，由神经元和星形胶质细胞合成的BDNF对损伤脊髓起神经保护作用；而在脊髓损伤后晚期，由小胶质细胞P巨噬细胞分泌的BDNF则对损伤脊髓起神经修复作用。而Uchida等则在压迫性脊髓损伤模型中发现，损伤脊髓头侧神经元胞体明显增大，伴之以树突的延伸。与之对应的是，前角细胞中BDNF免疫活性增强。在一个脊髓损伤更为严重的模型中，更多的BDNF免疫阳性物甚至扩展到星形胶质样细胞中。提示脊髓损伤后，BDNF在神经元和星形胶质样细胞中的表达程度与慢性脊髓损伤的严重程度成正比关系；内源性BDNF表达的增加在挽救受损脊髓神经元存活和促进神经突起再生方面具有重要意义。

(八)BDNF与脊髓损伤

BDNF在体外和体内均能支持受损CNS神经元的存活，但不是所有类型的脊髓神经元都可从BDNF获得营养支持，这可能与不同脊髓神经元的存活依赖于特定的营养支持有关。目前认为，脊髓损伤后，对BDNF有应答的脊髓神经元主要有红核脊髓束神经元(rubrospinal neurons，RSNs)、皮质脊髓束神经元和脊髓运动神经元等。此外，Novikova等认为，BDNF和神经营养因子－3(NT－3)对网状脊髓神元(RSNs)具有协同性神经保护作用，而联合应用BDNF和NT－3则远不及单独使用NT－3对Clarke核(CN)神经元的保护作用，提示CN神经元不是BDNF的应答对象。Bregman等发现，脊髓损伤后，在脊髓断端同时给予胚胎脊髓(fetal spinal cord，F脊髓)移植物和BDNF治疗可促进宿主5－羟色胺能、去甲肾上腺素能和皮质脊髓束轴突在F脊髓移植物中的生长。Bamber等把雪旺氏细胞作为一种连接损伤脊髓两断端的“细胞桥”植入脊髓损伤区后，给予BDNF治疗。结果发现，大量轴突通过雪旺“细胞桥”长入宿主损伤脊髓远侧区域。这些再生性轴突在损伤脊髓远侧区域内的延伸长度可达6mm，并形成类似终扣的结构。

可见，BDNF兼有阻止脊髓神经元死亡(神经营养性作用)和促进轴突再生(神经趋向性作用)两种作用。上述两种作用是否为共同的调节机制所调控?有学者将BDNF基因修饰型成纤维细胞(FBPBDNF)植入皮质下损伤的脊髓后发现，90%左右的皮质脊髓束神经元得以存活，但是并未观察到相应皮质脊髓束轴突的再生。相反，植入区其他类型神经元轴突的再生却明显增强。另外，TrkB免疫标记证实BDNF受体位于皮质脊髓束神经元胞体和树突尖顶部，而皮质脊髓束投射性轴突上并无BDNF受体的存在。表明成年CNS中同一类别的神经元可能拥有对NTFs不对等的存活和再生敏感性，而这种不对称的存活和再生敏感性可能与NTFs受体的分离性传输有关。

Sharma等认为，BDNF尚可下调脊髓损伤后血红素加氧酶(HO－2)和热休克蛋白(HSP)的表达增高(HO－2可促进一氧化碳的生成从而诱导细胞应激反应的发生)，并挽救血脊屏障(BSCB)的损毁(表现为BSCB对¹²⁵Ⅰ标记性白蛋白通透性增高)，进而抑制脊髓损伤后水肿的发生、发展。

Yick等发现脊髓损伤后，联合应用BDNF和NT－3可使损伤脊髓同侧内存活的CN神经元增加；同时表达一氧化氮合酶(NOS)的存活CN神经元亦得到增加。然而正常脊髓CN神经元不表达NOS。因此，外源性BDNF联合其他NTFs治疗所引起的CN神经元表达NOS的增加，究竟是BDNF的一种保护机制抑或是BDNF等NTFs治疗后的一种副作用尚不得而知。

此外，BDNF可增加损伤脊髓神经递质相关性酶的表达。这些神经递质相关性酶包括胆碱乙酰基转移酶(ChAT)及乙酰胆碱酯酶(AChE)等。Friedman等发现，坐骨神经切断所致脊髓后外侧核(retrodorsal lateral nucleus，RDLN)运动神经元ChAT的减少可被BDNF所抑制。Mocchetti等认为，BDNF增加合成神经递质所必需的关键酶表达的作用具有重要意义，即BDNF增加神经递质的合成用以补偿缺失或削弱的神经支配功能。

另外，Novikova等报告，BDNF尚可阻止脊髓损伤后RSNs内TrkB受体和微管相关性蛋白－2的表达减少。Kobayashi等发现，脊髓损伤后RSNs的萎缩与再生相关性基因如GAP－43和T₂微管蛋白的减少呈正相关，而应用BDNF后可抑制GAP－43和T_α1微管蛋白的减少，同时RSNs的萎缩被完全抑制。

Ikeda等发现，脊髓损伤后鞘内注射BDNF可改善脊髓损伤急性期内CuPZn超氧化物歧化酶(Cu Zn SOD)和髓鞘碱性蛋白(MBP)在脊髓神经元和胶质细胞中的表达衰减，从而对损伤脊髓神经功能的恢复起积极作用。McTigue等将BDNF分泌性成纤维细胞植入损伤脊髓组织后，损伤处轴突的再生显着增加。同时，MBP免疫反应活性明显增强。提示BDNF分泌性成纤维细胞植入脊髓损伤区可促进再生轴突的髓鞘形成。同时，溴脱氧尿苷(Brdu)标记阳性少突胶质细胞显着增多，表明BDNF诱导的损伤脊髓轴突的髓鞘化与其促进少突胶质细胞系的增生有密切联系。

(九)外源性BDNF治疗脊髓损伤的临床应用前景和存在的问题

鉴于外源性BDNF在脊髓损伤修复中的作用，有理由相信将BDNF应用于脊髓损伤的临床治疗不仅仅是个梦想。可喜的是，众多研究者已经尝试把外源性BDNF治疗应用于实验动物模型，努力探索BDNF治疗脊髓损伤的可行性，并在实验室条件下积累了一些行之有效的BDNF治疗方法。归纳起来，主要包括：①局部鞘内或髓内注射外源性BDNF；②神经组织或细胞移植联合使用BDNF；③FBPBDNF移植等。

1．神经组织或细胞移植联合使用BDNF

胚胎脊髓移植一直是脊髓损伤后再生修复的热点，被认为是最理想的移植物。胚胎脊髓具有如下优点：作为一个细胞桥的作用填充损伤区，引导轴突再生通过损伤区，为损伤区提供神经元和必要的NTFs等。有学者尝试将胚胎脊髓细胞移植联合使用BDNF法应用于脊髓损伤的治疗中。Chow等证实从胚胎14d(E14)的SD和Fishcher344鼠分离而得的胚胎脊髓细胞具有前体细胞的特性：在表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)存在时，以未分化的神经球形式进行增殖。这种胚胎脊髓细胞经核素染料或IacZ基因携带性重组腺病毒载体标记后，植入SD鼠经免疫抑制处理的受损脊髓(或Fis2chcher344鼠未经免疫抑制处理的受损脊髓)内。结果这种胚胎脊髓细胞植入后4个月，使用外源性BDNF可诱导植入的胚胎脊髓细胞向神经元和胶质细胞分化，进而为损伤宿主脊髓的再生提供“允许性”的环境。提示胚胎脊髓细胞移植联合使用BDNF将是一种有望治疗脊髓损伤的移植疗法。

2．BDNF基因修饰型细胞移植

BDNF基因修饰型细胞移植(即转基因移植)有望成为应用BDNF治疗脊髓损伤的最有效方法。该法分两步完成：首先，应用转基因重组技术将BDNF基因导入合适的受体细胞，然后把整合有BDNF基因的受体细胞进行体外培养后，植入脊髓损伤区。目前使用的受体细胞有雪旺氏细胞、成肌细胞、成纤维细胞等。经这些FBPBDNF移植后，可观察到脊髓损伤区有明显的再生交联区、损伤动物脊髓神经运动功能明显改善等现象。提示FBPBDNF基因修饰型细胞移植治疗脊髓损伤具有广阔的临床应用前景。

但是，作为一种基因治疗方法，FBPBDNF移植与其他基因治疗一样，不可避免地存在免疫排斥反应、受体细胞不能长期存活及受体细胞BDNF基因表达逐渐下降等问题。早先，为了消除基因治疗所带来的免疫排斥反应，学者们在将FBPBDNF植入损伤脊髓的同时，应用免疫抑制剂如环孢菌素A(CsA)等为修饰细胞提供了一个严格的免疫抑制性环境。但是，CsA等免疫抑制剂使用后所带来的毒副作用又不利于宿主脊髓的存活和再生。为解决这一矛盾，Tobias等向人们展示了一个诱人的方案：他们用胶囊把FBPBDNF包裹于藻酸盐－多聚－左旋－鸟氨酸内，因为后者可作为FBPBDNF的一层半渗透性膜。这样既保证了BDNF的合成和播散，又可使FBPBDNF免受宿主免疫系统的攻击。这种胶囊包装的FBPBDNF植入宿主脊髓后，能够存活、分泌生物活性因子BDNF，并维持生长至1个月以上。此外，将包装后的FBPBDNF贮存于液氮中，可保持其生长和表达BDNF基因的活性。在缺乏免疫抑制性环境(如CsA)的条件下，包装后的FBPBDNF植入成年大鼠损伤的颈髓后仍可存活至少1个月。移植后2周，包装后的FBPBDNF表达BDNF的能力开始下降，但将这些FBPBDNF重新培养后，其表达BDNF的能力即可恢复。提示FBPBDNF转基因表达能力的下降可能与宿主脊髓免疫反应后产生的可溶性因子有关。另外，在包装后的FBPBD2NF植入区内充盈了大量的神经突起，证明这种胶囊包装后的FBPBDNF具有神经性促进作用。可见，Tobias等提供的这种FBPBDNF模型，既可使宿主脊髓免遭CsA等免疫抑制剂的毒害，又可使FBPBDNF在一个非免疫抑制的环境下避开宿主免疫系统的攻击，较成功地解决了基因治疗所带来的免疫排斥反应，不失为一种有效可行的方法，值得参考。

但是，BDNF治疗脊髓损伤并非十全十美。就目前研究而言，BDNF治疗脊髓损伤存在的问题主要包括：①BDNF给药途径。由于BDNF不能直接透过血－脑屏障(BBB)及血－背屏障B，因此，BDNF既不能口服从消化道给药亦不能经静脉血管给药，这极大地限制了BDNF在临床的推广应用。而选择局部鞘内或髓内注射BDNF虽可行，但BDNF的作用亦将随之被局限在注射局部，故其治疗效果明显折扣。同时，此种治疗创伤大，副作用也较多。此外，尽管转基因移植疗法不失为治愈脊髓损伤最有前途的途径，但目前此治疗手段仅限于实验阶段，其涉及的研究领域最广，技术难度也最大。因此，转基因移植疗法真正应用于临床还有一段很长的路要走。②BDNF治疗作用的局限性。对BDNF应答的神经元类型是有限的，这亦表明单独使用BDNF并不能完全解决脊髓损伤的所有问题。因此，不应忽视BDNF与其他NTFs的协同性作用。此外，BDNF治疗的副作用也应引起人们的重视。

总之，一方面，外源性BDNF在脊髓损伤修复及治疗中具有美好的临床应用前景；另一方面，尚存在很多问题亟需解决。首先，BDNF在脊髓损伤修复中的作用机制还远未阐明；其次，目前研究提供的BDNF实验性治疗方法还远未成熟，例如众所周知的基因治疗所面临的诸多问题等。因此，只有真正解决好这些问题，人们才可能迎来BDNF用于临床治疗脊髓损伤的一天。

三、神经营养因子－3(NT－3)

NT－3由Ernfors等于1990年发现，根据来源及生物活性首先命名为海马源性神经营养因子(hippocumpus derived neurotrophic factor，HDNF)。同年，不少学者根据NGF、BDNF相同部分的氨基酸序列克隆出NT－3。因其是继NGF和BDNF之后发现的NGF家族的第3个成员并具有维持神经元存活和促进神经突起生长的营养活性，故命名神经营养因子－3。

(一)NT－3的分子结构

NT－3是一种小分子量碱性蛋白质，分子量13．6kD，等电点9．3，与NGF和BDNF具有相似的一级结构。成熟NT－3分子由119个氨基酸组成，分为保守区和可变区。1990年Ernfors等首先合成含282个氨基酸序列的蛋白质前体。C₂端包含了一个可以分离出119个氨基酸的潜在断切位点，在这119个氨基酸中包含6个以二硫键相连的半胱氨酸，这有助于维持NT－3分子的稳定性，提示与生物活性有关。成熟蛋白质前面的氨基酸序列表现较弱，但与NGF同源，为N－末端序列，作为信号肽；成熟蛋白质后起第9个氨基酸处有一个N－糖化位点，这一段为源序列。NT－3有长短两种前体，前体蛋白经过蛋白分解产生具有生物学活性、成熟的NT－3。

(二)NT－3的分布

在神经系统，NT－3主要分布于背根节、脊髓、脑干、小脑和海马等。ZhouX F等发现，NT－3样免疫反应物质在中枢神经系统的分布既涉及神经胶质细胞又涉及神经元，前者主要分布于胼胝体、黑质、海马伞、室管膜下区和小脑等处；后者主要分布于隔核，Broca斜角带，原始嗅皮质，杏仁核，终纹底板核，三叉神经中脑核，丘脑网状核，小脑深核，中脑，海马的Calleja岛及CA1、CA2、CA3外侧区的锥体细胞，背侧齿状回的颗粒细胞，脑干和脊髓运动神经元，大脑皮质第5层的锥体细胞和小脑Purkinje细胞等。在非神经系统，NT－3主要分布于脾、肾和肠。

(三)NT－3 mRNA的分布

在神经系统中NT－3mRNA主要分布于小脑、海马和大脑皮质等。在海马中NT－3mRNA阳性的神经元呈明显局部解剖排列。海马背的前部，即CA1、CA2中部神经元表达高水平的NT－3mRNA；CA1的外侧区也表达一些NT－3mRNA；齿状回的颗粒细胞也表达高水平的NT－3mRNA；CA3和门细胞不表达。在非神经系统中以肾脏表达水平最高，还包括心、肺、肝、脾、肠、骨骼肌、皮肤、胎盘、胸腺、卵巢和肾上腺等。Nosrat等用原位杂交组织化学方法发现，NT－3mRNA在发育和成人舌中的上皮层、味觉菌状乳头、线状乳头中有不同程度表达，提示NT－3对人味觉和本体感觉神经支配的开始和平衡起很大作用。研究发现，不同发育时期NT－3mRNA表达含量不同。如：与NGF和BDNF相比，NT－3mRNA在新生鼠脑内含量高于成熟鼠脑，胚胎期脑干和脊髓可以检测到较高的NT－3mRNA，新生发育期最高，以后逐渐降至成体水平。有文献报道NT－3及其mRNA的分布呈现重叠或分离表达模式，提示NT－3的生理作用方式可能涉及自分泌或旁分泌机制。

(四)NT－3受体

NT－3依赖与细胞表面受体结合发挥生理作用。功能受体为高亲和力受体酪氨酸激酶受体C，即TrkC；此外尚有低亲和力受体P75NTR，是肿瘤坏死因子受体家族成员之一，TrkA、TrkB可与NT－3结合。TrkC是在1991年由Lamballe等克隆并鉴定为NT－3功能受体。TrkC基因产物为145kD的糖蛋白，gp145trkc。TrkC蛋白为825个氨基酸多肽，包含信号肽(1～31)，含有14个一致的N－糖化位点(Asn-X-Ser／Thr)的长细胞外区域(32～429)，单一跨膜区域(430～453)和胞浆区域(454～825)。TrkC主要在脑内表达，TrkC转录本主要分布在海马锥体细胞层和齿状回、大脑皮质外层细胞簇、小脑颗粒细胞层，但在白质、Purkinje和分子细胞层中未发现。这些区域也表达NT－3分子，提示NT－3与rrkC产生联合自分泌环，对神经元存活起一定作用。对人脑干TrkC分布研究发现，脑桥和下橄榄核含TrkC强阳性神经元；脑神经运动核及部分感觉核含TrkC中等强度或较强阳性神经元；上下丘、大脑脚背盖、中缝核、网状核也含有TrkC阳性神经元；黑质及蓝斑区色素细胞内仅见淡染阳性产物，但黑质网状部的非黑色素神经元却为中等或强阳性；分布模式及染色强度未见年龄差别。TrkC在人脑干内广泛而有选择的分布说明NT－3在成年及老年脑干神经通路中有调节作用。TrkC mRNA在成年大鼠周围和中枢神经系统内主要分布于：嗅觉系统、海马齿状回颗粒细胞层和海马门、脑干下橄榄核神经元、间脑三叉感觉神经元、蓝核、面神经和三叉神经神经元、舌下运动神经元、脊髓运动神经元等，在疑核神经元中也有低表达。与NT－3不同的是，从胚胎期到成体，在黑质细胞亚群体中，TrkC mRNA的表达是由低到中等的水平。TrkC mRNA在新生期和成体大鼠脑中的高水平表达，提示整个大鼠发育过程中大脑的这一区域都存在NT－3反应细胞。

(五)NT－3的生物学活性

1．维持神经元存活

体外培养研究表明，NT－3可维持交感、感觉、基底前脑胆碱能和运动神经元的存活。如NT－3可保证三叉神经中脑核神经元的90%以上、背根节神经元的60%以及结状神经元的30%存活。之外，将NT－3、BDNF或NT－4／5加入培养的E16大鼠基底前脑胆碱能神经元中，还发现NT－3可明显增加神经元数量。近年，不少研究又提供了NT－3能促进培养脊髓运动神经元存活的相关资料。如新生大鼠面神经切断后，局部应用NT－3可分别防止30%的面神经运动神经元死亡。而在NT－3基因突变的新生小鼠，由于缺乏NT－3而导致颈上节神经元数目比正常减少50%。这些结果均为NT－3支持神经元存活提供了有力的形态学证据。值得一提的是，NT－3在背根节(dorsal root ganglia，DRG)的作用既广泛又独特。Airaksinen MS等利用神经化学标记系列发现，NT－3缺乏不仅使DRG本体感觉神经元丢失，而且使包含降钙素基因相关肽、P物质和硫胺素－磷酸酶活性的小细胞丢失，提示NT－3缺陷可致不同种类的感觉神经元大量丢失。但是，目前大多数文献报道仍主要集中在NT－3缺乏可致DRG大神经元丧失，进而影响本体感觉传入。表明NT－3对本体感觉神经元发育至关重要。

2．促进神经细胞分化和诱导轴突生长

研究证实，NT－3能在体外上调胆碱能神经元乙酰胆碱转移酶的表达，支持中脑多巴胺能神经元分化，以及促进发育和损伤的皮质脊髓束(corticospinal tract，CST)侧枝出芽。Ringstedt T等发现，过度表达NT－3的转基因小鼠出生时，其DRG中神经元和轴突的数目增加。此外，一些感觉神经纤维投向NT－3异位高水平表达的脊髓中线上，而投向运动神经元的Ia传入神经中枢轴突则缺乏。提示NT－3可促进本体感觉神经元分化及其轴突向靶点扩展和投射形成。

(六)NT－3在神经损伤修复中的作用

研究发现，NT－3能够营救坐骨神经切断后L₄和L₅节段DRG感觉神经元的45%，对运动神经元则无此效应。Mc2Tigue DM等将能够分泌NT－3、BDNF、NGF等的基因转染成纤维细胞移植到脊髓损伤处，发现损伤后第10周，所有移植物中都有轴突生长，NT－3和BDNF者尤其明显且含有更多的髓磷脂碱性蛋白阳性纤维丝，表明在这些移植物中生长的轴突髓鞘形成增加。由此推测能够分泌神经营养因子(neurotrophins，NTs)的移植物可用于治疗SCI后慢性脱髓鞘病变。Brad2bury EJ等在成年大鼠胸段制造脊髓半切损伤并用氟－金标记轴突切断的神经元，通过原位杂交实验发现，TrkB和TrkC在大部分上行投射神经元表达，提示这些细胞可能对BDNF和NT－3反应。另外，应用NT－3可使3／4的萎缩细胞逆转，存活细胞的数目也明显增加。看来，NT－3还可防止SCI后继发性神经细胞丢失。Schnell L等研究NGF、BDNF和NT－3对CST的作用发现，成体大鼠胸段横断CST后，局部注入NT－3，5天后，该束有侧枝出芽；而将髓磷脂相关突起生长抑制蛋白抗体(MAG)和NT－3一同注入，可见CST的侧枝出芽长度增加。提示联合应用NT－3MAG抗体可增加横切的CST再生出芽长度。Zhou XF等用原位杂交和免疫组化技术研究NTFs缓解周围神经系统(peripheral nervous system，PNS)损伤引起的慢性疼痛综合征，发现早在神经损伤后48h，DRG中损伤神经元的卫星细胞表达NGF和NT－3就明显上调，此反应至少持续2个月。定量分析表明，NGF和NT－3的mRNA水平增加只涉及损伤同侧而非对侧。另外，经受损的L₅脊神经注入特异性NGF和NT－3抗体，肾上腺素能神经出芽明显减少。由于断轴突DRG神经元周围的去甲肾上腺素能神经出芽与P75免疫反应性星形细胞有关，而PNS损伤后慢性疼痛综合征是损伤DRG大细胞感觉神经元周围的交感神经和肽能神经末梢出芽并与损伤神经元所致，从而提示卫星细胞源性NTFs可能对减少PNS损伤引起的交感神经出芽有作用。有趣的是，Siuciak J A等将NT－3及BDNF注入大鼠中脑，发现其拍尾反应的潜伏期延长，24h后出现镇痛作用，第5d达高峰，此后6d仍有作用，未出现耐受性。另外还发现，脑和脊髓内5－HT活性相应升高，提示NT－3和BDNF有抗痛效应并可能涉及5－HT及阿片两种机制。类似之，Malcangio M等研究NGF和NT－3诱导痛阈和P物质释放变化的实验结果也提示，NT－3可能通过抑制P物质样免疫活性物质释放从而发挥抗痛效应。综合现有的文献提示，NT－3在神经损伤修复中的作用可能至少涉及营养和镇痛两个方面。但其详细的作用机制还有待深入研究。

(七)NT－3的临床应用及前景

由于NT－3的生理作用，它有可能对周围神经炎、颅脑伤、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化症、老年痴呆症、神经系统肿瘤等均有治疗作用。NT－3治疗作用最有力的证据在于它在神经疾病动物模型中的高效作用。因为NT－3在体内可以调节中等大小纹状体凸起神经元表型的两个独立方面：细胞体区域和神经肽表达。而且NT－3在喹啉化HD模型中可以降低损伤面积和阻止变性改变，提示NT－3在HD的治疗中可能发挥作用，保护纹状体凸起神经元免于萎缩和阻止神经递质的丢失。在6－羟基多巴胺损伤动物模型中，NT－3可以阻止蓝斑去甲肾上腺素能神经元死亡，而Alzheimer's病中去甲肾上腺素能神经元减少主要在蓝斑前角部分，并且受损神经元的突起位于血－脑屏障外，给NT－3治疗Alzheimer's病的应用提供了可能。在新生鼠中，顺铂可以减少有髓神经元数目，降低感觉神经信号传导速度，并且诱导背跟节神经元内神经微丝蛋白的不正常分布。经过9周顺铂照射造成的异常反应，再经5周3次／周给NT－3分子1．0μg／kg后，全逆转了。这些数据有力地证实了NT－3在延迟治疗修复病理表型中起很大作用。在应用连脲霉素的糖尿病鼠中，NT－3能明显减弱腓肠肌神经纤维直径的减少，说明NT－3对糖尿病引起的外周神经疾病有一定的医疗潜力。周围神经损伤经常并发慢性疼痛症状，已证明与交感神经有关。横断左侧L₅脊神经后，试验组中对小鼠腹腔注射NT－3特异性抗血清，2次／周达2周。在损伤后第1、3、7、10和14天，检测冯－弗雷毛发撤足反应，再用酪氨酸羟化酶(TH)检测背根结中交感神经芽生情况。对照组中，TH免疫纤维和围绕大神经元的篮状细胞显着增加；而试验组中交感神经芽生和篮状细胞形成明显降低，并且冯－弗雷反应也降低。提示周围源性NT－3在周围神经损伤后对降低交感神经芽生和缓解神经病疼痛有一定作用。由于NT－3不能通过血－脑屏障，只能局部给药，依靠反复室管膜内注射或借助于侵袭性微管装置来给NT－3，应用不方便。目前看来基因治疗方法是最有希望的。用基因工程方法获得rhNT－3构建高效安全的基因转移系统和达到转移基因长期稳定表达，是利用NT－3进行基因治疗的关键。同时还需要大量动物实验以获得精确结果。因皮质脊髓束对NT－3敏感并且在周围神经移植中Schwann细胞不产生NT－3分子，Blits等把编码NT－3的腺病毒载体转导入肋间神经内，16周后与对照组相比，试验组在损伤以下皮质脊髓束纤维和新生通过灰质的轴突明显有3到4倍的增加。周围神经用NT－3重组腺病毒转导，小鼠后肢功能也有提高。因此把神经移植与NT－3基因载体转导结合起来可以加快受损皮质脊髓束再生和后肢功能恢复。当基因治疗在理论和技术上获得重大突破时，NT－3的应用有望得到发展。基于NT－3在动物模型中作用的研究，Amgen和Regeneron合作发起了NT－3临床试验。一期研究在70名健康人中进行，志愿者接受单次或多次NT－3注射，剂量为0．3～250．0μg／kg，结果显示NT－3被良好耐受。将在动物身上产生良好效果的剂量应用于人很安全，但出现副作用时的具体剂量不明。二期研究计划评测出NT－3在治疗糖尿病外周神经疾病上的效用和安全性。尽管NT－3在临床试验上取得了初步进展，然而不可忽略的问题仍然存在，如：其选择性不高，不太可能用来专门影响脑内某一特定的神经元，以及从动物模型到临床应用的几点障碍：①动物模型不能完全模仿人体内神经变性过程和速度；②将NT－3应用于人应掌握的准确剂量不明；③副作用；④NT－3的药物动力学。而且NT－3分子与别的蛋白因子是否有拮抗作用也不明。随着研究的进一步深入，有理由相信，NT－3在临床应用方面会取得丰硕成果。

四、神经营养因子－4／5(NT－4／5)

Hallbook、Berkemeier和Nancy等分别从非洲爪蟾和哺乳动物发现了NT－4和NT－5，二者实际上为一种神经营养因子。

(一)NT－4／5的分子结构及分布

人的成熟NT－4／5在体内以二聚体形式存在，分子量为13．9kD，等电点为8．98。成熟NT－4／5由130个氨基酸构成，其中6个半胱氨酸以二硫键相连，信号肽含18个氨基酸，其三维结构不明。NT－4／5的前体由210个氨基酸组成，裂解位点为Arg-Arg，糖基化位点数1个。NT－4／5在中枢和外周神经系统中分布很广，在运动神经元、基底前脑胆碱神经元与海马、下丘、延髓等处均有存在。在新生和成年鼠脑中，NT－4／5在海马和脑皮质中有表达。在新生鼠脑皮质中，NT－4／5在锥体外层最多；而在成年鼠脑皮质中，NT－4／5在锥体内层最多。在成年鼠脑海马中，NT－4／5存在于Ammon's角锥体细胞层中；而在新生鼠脑海马中，NT－4／5存在于锥体细胞层以外。NT－4／5还存在于背侧丘脑核、橄榄核以及小脑Purkinje细胞中。

(二)NT－4／5的分子生物学

1．NT－4／5的基因

王爱坤等以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板，PCR扩增出NT－4／5编码基因。将所得基因片段重组于噬菌体载体M13mp18RF，筛选得到含人NT－4／5基因的克隆，采用Sanger单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献报道的完全一致。人NT－4／5的基因位于19q13．3，虽然其长前体基因编码仍不清楚，但其短前体基因则由单一外显子编码，可以很容易地通过PCR将其完整表达。推测其前导序列在成熟NT－4／5的折叠、加工、运输及二聚体化方面发挥着重要作用，可能与NT－4／5的生物学活性紧密相关。前导序列中的信号肽有助于将NT－4／5分泌至真核细胞外，表达产物具有较高的生物学活性。

2．NT－4／5的mRNA

NT－4／5有4个转录本，大小分别为1．1kb、2．1kb、4．0kb和9．0kb。它们分布于有限的周围组织中：前列腺中最多，其次是胸腺、胎盘和骨骼肌，睾丸中最少。其中3个较小的转录本在上述部位都有表达，最大的转录本只在骨骼肌中有表达。NT－4／5mRNA的水平在出生后随着年龄的增长而增高。

(三)NT－4／5的受体

基础研究发现，NT－4／5必须与特异性受体结合，通过信号转导机制才能发挥其作用。NT－4／5有2类特异性受体：低亲和力的P75受体和高亲和力的TrkB受体。

1．P75受体

P75受体属于肿瘤坏死因子受体家族，它由426～427个氨基酸残基组成，分子量为49kD，糖基化后的分子量为75kD，故称为P75受体。它没有酪氨酸激酶活性，也没有G蛋白结合位点，可以与各种NTFs结合。P75受体能提高Trk受体配体的识别力。在NTFs的逆向传导中，P75受体起到重要作用。

2．TrkB受体

Trk受体由3个部分组成：一个细胞外结合识别区域，一个信号跨膜传递区域和一个含有酪氨酸激酶的胞浆尾部区域。与特异性NTFs结合后，激活使其自身发生磷酸化，第二信使生成，从而进行信号传递。其中TrkB受体为NT－4／5的特异性信号传递受体。盖卫平等用免疫组化方法证明TrkB阳性胞体和突起广泛分布于脑干不同区域：黑质、脚间核、脑桥和下橄榄核含有TrkB强阳性神经元；脑神经运动核及部分感觉核含TrkB中等或较强阳性神经元；上丘、下丘、大脑脚背核、中缝核、网状核也含TrkB阳性神经元。在分布模式及染色强度上未见年龄差别。以上结果说明NT－4／5在成年及老年脑干神经通路中具有调节作用。人的TrkB受体有“全长”(full-length TrkB)和“掐头”(truncated TrkB)两种形式，目前发现有两种TrkB的掐头形式：TrkBT₁和TrkBT₂，分别只有23和21个氨基酸。与全长型相比，TrkBT₁和TrkBT₂具有等长的胞外区域，胞内区很短，缺少胞浆酪氨酸激酶区域。全长型在中枢神经系统发育早期大量存在，而TrkBT₁的数量在中枢神经系统发育晚期会超过全长型。这几种形式的受体对树突分枝有着不同的作用。其中全长型能增加邻近树突的分枝，而掐头型能加强远处树突网的延伸。TrkBT₁在中枢神经系统中的作用尚不清楚。一般认为，掐头型在离体状态下起着与全长型相反的负调节，也就是说，掐头型能在不依赖全长型的情况下诱导其自身的信号级联反应。这些并不意味着它们相互间的排斥，相反，NT－4／5的调节是由二者参加的一种复杂机制，它们或联手或独立起作用。TrkB的mRNA分布于以下部位：①大多数嗅觉小泡和前嗅觉神经核；②神经皮层中大部分神经元；③基底节大多数中小型纹状体神经元和一些大神经元，及外侧苍白球的一些小神经元；④海马中带状结构神经元和齿状回颗粒细胞层；⑤大多数丘脑核神经元；⑥大部分下丘脑尤其室旁核和视上核部位神经核；⑦扁桃腺前区神经元；⑧中脑大多数大中型神经元；⑨脑干面神经、前小脑、脑桥和红核处神经核；⑩小脑颗粒细胞层。此外，在灰质、白质、外侧角和背角中也有存在。

(四)NT－4／5的生物学活性

研究发现NT－4／5既可以作为靶源性逆向神经营养因子影响其上级传入神经元，也可通过顺轴突转运影响其远端靶细胞，还可通过旁分泌、自分泌方式影响细胞及组织。NT－4／5具有广泛的生物学作用，可以促进神经元生长、发育、分化与成熟，维持神经元存活及促进神经元损伤修复与再生。

1．NT－4／5可维持神经元的分化和存活

NT－4／5可减少发育中运动神经元的丢失，还可提高轴突切开的视神经节细胞的存活。体外实验证明，NT－4／5在中枢神经系统中的作用主要为支持胚胎期海马胆碱能神经元、去甲肾上腺素能神经元和纹状体GABA能神经元、多巴胺能神经元的表达和存活。Bing chen等发现NT－4／5可以使培养的胚胎鼠海马和皮质神经元免受由葡萄糖缺少引起的损伤。在加入NT－4／5的培养物中，神经元对由钙离子载体A23187诱导产生的毒性有很强抵抗力，说明NT－4／5增强了神经元对钙介导损伤的抵抗力，这可能是NT－4／5保护神经元存活的一个机制。Human C等研究发现NT－4／5在无神经胶质细胞的培养物中能促进黑质多巴胺能神经元存活与分化，又因为发育和成体黑质神经元表达TrkB受体，因此NT－4／5的这种效应很可能是在此神经元上直接作用的结果，而不是通过支持细胞。Juner等发现体外培养的皮质脊髓运动神经元存活数量与加入的NT－4／5含量有关。NT－4／5在运动神经元损伤后能诱导神经调节素表达增多，表明NT－4／5的作用还涉及神经元的生理和病理过程。陈彦红等提供了L₆节段灰质神经元NT－4／5分布的免疫组织化学证据，结果表明脊髓神经元含有NT－4／5，提示NT4／5可能与脊髓神经元的生理功能有关。该结果为进一步探讨NT－4／5在神经损伤后的变化及作用奠定了基础。Vassilis等证明，NT－4／5能阻挡新生鼠面部神经元的损伤性死亡，而且面部神经元表达了一个NT－4／5的功能性载体。因此NT－4／5可能是面部神经元存活的生理因子，同时也是面部神经元疾病的治疗剂。

2．NT－4／5对小胶质细胞的调节

刘永茂等研究NTFs对培养的小胶质细胞分泌的血浆纤维蛋白溶酶原(PGn)及其激活因子(uPA)的调节作用。他们利用NT－4／5对体外培养的大鼠脑小胶质细胞进行刺激，然后采用酶谱分析法、免疫印迹法及免疫化学分析法对其产生的PGn和uPA进行测定。结果显示NT－4／5对所测定的酶原及其激活因子皆有上调作用。提示在体外NT－4／5有调节小胶质细胞的作用。

3．NT－4／5对味觉发育的作用

Daniel等研究了新生鼠在缺少NT－4／5情况下，味蕾的发育和生长情况。结果发现，缺少NT4／5将导致味觉在接受刺激上的缺陷和菌状乳头的减少。在出生后3星期内，菌状乳头没有退行性改变，但在外形上较小，并且许多没有味孔。在出生后60天，菌状乳头的数量减少了63%，外形上更小，而且没有味蕾和味孔。这些发现证明，NT－4／5对维持菌状乳头的发育和生长有重要作用。

4．NT－4／5在视觉中枢发育中的作用

NT－4／5可影响眼优势柱的发育。视皮质内有大量TrkB表达。改变NT－4／5的水平会影响到眼优势柱的发育。Cabelli等用渗透微泵方法将NT－4／5在小猫关键期顶峰期间施加于视皮质。经2周灌注后，用形态学手段检测猫眼优势柱。结果显示，NT－4／5阻止了局部灌注神经营养因子区域内眼优势柱的形成。随后，Cabelli等又将神经营养因子拮抗剂(由TrkB的胞外段和IgG的Fc段构成的一个嵌合蛋白)注入视皮质，结果表明只有TrkB-IgG可以抑制眼优势柱的形成。这进一步说明，正常时以有限量存在的TrkB内源配基对于外侧膝状体末梢分化成眼优势柱是必需的。NT－4／5可影响外侧膝状体分层。Riddle等将NT－4／5与荧光乳胶微球结合，局部注入单眼剥夺雪貂的视皮质的左右眼优势柱区域内。分析表明，NT－4／5可以避免单眼剥夺造成的外侧膝状体神经元胞体萎缩，但对于正常眼驱动的神经元没有作用。而且单眼剥夺数周后再注射NT－4／5也不起作用。这表明，局部高浓度的NT－4／5使得由剥夺眼驱动的神经末梢也能摄取足够的NT－4／5。NT－4／5在视神经元上的表达模式尚不清楚，所以NT－4／5是否直接作用LGN轴突仍需有力的证据支持。

5．NT－4／5对外周神经损伤的修复作用

侍坚等应用逆转录病毒介导的体外NT－4／5转移方法，制备高表达NT－4／5的基因修饰细胞。离断大鼠左侧坐骨神经作为外周神经损伤模型，右侧为对照，在离断处移植NT－4／5基因修饰细胞，观察大鼠脊髓前角运动神经元尼氏染色和胆碱酶染色变化。结果在试验组和对照组间，尼氏染色和胆碱酶染色有显着差异。提示移植NT－4／5基因修饰细胞对外周神经元损伤所造成的运动神经元退变有显着的改善作用。所以，这对于NT－4／5治疗作用的研究以及基因方法用于临床是很有意义的。

(五)NT－4／5的临床应用

NT－4／5对神经元有促进存活、生长和分化作用。由于NT－4／5可以保护海马和皮质神经元抵抗兴奋毒素和代谢损伤，因此它对卒中、癫痫、Alzheimer's病和创伤性脑损伤等有神经变性的几种疾病有重要作用。最新的研究发现，NT－4／5对神经肌接头的形成有促进作用，它能诱导正常运动神经元侧枝出芽，因而NT－4／5对运动神经元疾病有潜在的治疗作用，如神经元损伤修复、肌萎缩性脊髓侧束硬化症等。因为NT－4／5不能通过血－脑屏障，所以可通过以下途径应用：①通过留置导管间歇性注射或物质泵传导至脑脊液或脑实质；②蛋白修饰以促进转运通过血－脑屏障；③间接途径，如移植分泌NT－4／5的合适细胞；④直接基因转导入中枢神经系统细胞；⑤发展可以在特定位点上调特定生长因子并可通过BBB的小分子；⑥发展靠激活NT－4／5受体或激活信号传导途径来直接模仿NT－4／5的可通过BBB的小分子兴奋剂。对于神经损伤和某些退行性疾病的治疗需要长期用药，这是比较困难的，用基因治疗方法则可通过一次或几次治疗得到长期有效的治疗结果。

五、神经营养因子－6(NT－6)

Gobtz等在克隆硬骨鱼(Xiohophorus)的NGF时，意外地发现了NT－6。它不同于其他的神经营养因子，为神经生长因子家族又增添了新的成员。NT－6不同于其他的已知神经营养因子，因为它不是构成细胞介质的可溶性蛋白质，而是通过肝素结合在细胞表面和存在于细胞外基质中，使这种分子更具有组织和细胞特异性，同时也提供了细胞外贮存的基础。在胚胎小脑原基中有NT－6 mRNA的表达，在某些成熟组织中也有表达，但它在体内的生物学效应的研究报道尚少。