目前基础研究的热点
出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第594页（8582字）
传统观点认为，中枢神经系统损伤后由于自身的再生能力差和外在环境抑制，神经不能再生。脊髓是中枢神经系统的重要部分，轴突损伤后也不能再生。但近年来有研究发现，中枢神经系统损伤后轴突可再生长入周围神经移植物内，表明中枢神经系统的微环境对轴突再生起关键作用。研究还发现，中枢神经系统轴突的再生能力随着与细胞胞体的距离增加而减弱，远端已几乎无再生能力。其原因是远端损伤的轴突不能调控生长相关基因产生大量生长相关蛋白，后者对控制轴突生长具有特别重要的意义。而应用营养因子可增加轴突生长的能力，但通常这要在已建立再生环境的情况下。最新的研究证实，脊髓损伤后存在抑制因子，它能降低自发和移植诱发轴突的再生能力。应用它们的特异性抗体注入脊髓损伤的大鼠后可改善其运动功能。所以，为达到成功再生的治疗目的，要尽可能减少甚至消除不利因素，同时提供外源性的有利因素。这也提示我们，只要能创造一个适合神经元存活和突起生长的微环境，损伤脊髓的再生修复将成为可能。
一、神经营养素族神经营养因子(neurotrophicfactors，NTFs)
成熟的神经元与胚胎神经元相比，成熟神经元缺乏内在的轴突延伸和再生能力。NTFs是能够促进和维持神经元生长、生存、分化和执行功能的特异蛋白分子。不少研究已经显示使用NTFs后能增加神经存活和脊髓轴突的再生发芽。根据NTF的分子结构、受体和生物学功能，可将NTFS分为：神经生长因子家族，如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子－3(NT3)、神经营养因子－4／5(NT－4／5)；睫状神经营养因子(CNTF)；胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)家族；运动神经元营养因子等。以上所有蛋白质分子都已经进行了合成、克隆、纯化，并在受体、细胞、组织、器官和整体水平上进行了生物效应观察，证明这些神经营养因子在动物体内支持胚胎神经、新生动物和成年动物脊髓运动神经元的存活，并能挽救损伤脊髓运动神经元免遭变性死亡。在轴浆运输阻断后保护新生的运动神经元和轴浆的逆行运输，可以增加培养脊髓运动神经元对早期死亡的抗衡能力，减少中枢神经系统(CNS)损伤后兴奋性毒性的释放。NTFs对细胞凋亡及其分子调控、对神经损伤和再生、对神经元的可塑性以及对神经退行性病变的治疗有明显的生物效应，是重要的运动和感觉神经元的营养因子，可以保护和促进损伤神经元的修复。有研究表明每种神经元对一种特异的NTFs或几种因子的组合敏感：CNTF+BDNF适用于运动神经疾病、NT－3+CNTF有助于运动神经元的存活、BDNF+NGF可保护濒临死亡的感觉神经元、BDNF+NT－3可促进脑干神经元轴突长入横断脊髓间的移植物内。不过尽管NTFs可以使轴突发芽有所增加，但其生长距离很短；并且NTFs通过渗透性泵的传送或体外基因治疗也许可以诱导过渡发芽，这可能导致异常连接和感觉功能失调；另外NTFs干预脊髓损伤的时间也非常关键。NTFs治疗脊髓损伤未来成功与否将依赖于这些问题被解决得好坏。
二、胚胎脊髓移植
经多年探索证实胚胎脊髓具有促进分化、发育，以及在发育分化过程中向宿主组织投射神经纤维的能力。脊髓移植的目的是恢复损伤脊髓的解剖连接，实现功能重建；同时使受损神经细胞提供修复所需要的营养物质或生长因子，使受损细胞继续生存和生长。截至目前为止，胚胎脊髓修复研究都以动物实验为主。国内外学者证明，胚胎脊髓移植物不仅可以在受损脊髓内存活、发育、分化，而且能够与宿主脊髓互相投射部分神经纤维，建立一些神经通路，并产生整合。胚胎脊髓可明显抑制脊髓内胶质细胞的增生，减少瘢痕形成；胚胎脊髓还可填补损伤脊髓的组织缺损，挽救特定部位(侧后红核和Clarke’s核)的神经元而使其减少凋亡和病理性坏死。胚胎脊髓移植后宿主脊髓的运动、反射及内脏功能均可得到不同程度的恢复。虽然取得了上述令人信服的结果，由于人和其他动物之间存在种族生物学差异，宿主免疫排斥反应等问题，SCI远近端的功能性突触连接尚难以在灵长类中实现。
三、细胞移植
《神经创伤学杂志》创办人Wise Young教授认为在未来2年内细胞移植将成为临床治疗脊髓损伤的试验热点。目前细胞移植的研究主要集中在雪旺氏细胞(Schwann，SC)、神经干细胞(neural stem cells，NSCs)以及嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell，OECs)等。
外周神经系统中雪旺氏细胞不仅可为再生的轴突提供导向的管道，并且还可合成大量的有利于神经轴突再生的生长因子，如NGF、BDNF、睫状神经营养因子，这些NTFs可促进濒临死亡的神经元的存活；雪旺氏细胞表面的细胞粘附分子(CAM)与轴突生长锥表面相应的分子亲和性结合；雪旺氏细胞分泌的细胞外基质(ECM)与生长锥表面的细胞外基质受体结合，以上作用可以使生长锥内细胞骨架成分及第二信使反应性变化，导致轴突生长延伸。已有学者证实，将体外培养的该细胞或含有雪旺氏细胞的基质注入受损的脊髓处，可观察到再生的轴突数量增加。Martin研究了注入雪旺氏细胞的最佳时机，他在脊髓损伤的同时注入雪旺氏细胞，发现该细胞存活良好，星形胶质细胞减少；当移植物注入延迟时，星形胶质细胞已广泛繁殖，动物的功能恢复不良。尚有一些学者应用富含雪旺氏细胞的生物相容性导向管来诱导轴突的生长，脊髓完全横断的动物模型中可观察到轴突开始长入这些管道。由于雪旺氏细胞的上述特性，经严格论证已在临床上开始使用。
1992年Reynolds等从成年鼠纹状体中首次分离出能在体外持续增殖并具有向神经细胞及星形胶质细胞分化的多潜能的细胞群。1998年Eriksson等证实成年人脑内同样存在神经干细胞。目前已经证实，哺乳动物的神经干细胞在胚胎时期存在于脑室周围、皮质、海马、脊髓等处，而成年哺乳动物大部分脑区不具有产生新生神经元的能力，但在海马结构的齿状回和环绕侧脑室的室管膜下层与纹状体中存在神经干细胞。人们对神经干细胞分离培养的成功，为神经系统的损伤修复和退行性病变的治疗带来了新的希望。神经干细胞是中枢神经系统内处于未分化状态、能够自我更新复制、具有多向分化潜能的一类细胞，可进一步分化产生神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等神经系统成熟的细胞。神经干细胞不仅是研究神经发育的良好材料，也是中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料。移植的神经干细胞不仅能根据宿主的微环境分化为相应谱系的神经细胞以替代因损伤缺失的细胞，促进神经回路重建，还可作为损伤部位上下神经通路的中继站。1999年McDonald等将来源于鼠胚胎干细胞的未分化神经细胞植入鼠脊髓损伤部位，结果显示大鼠麻痹的后肢获得了一定的功能改善。Toda等的实验进一步表明神经干细胞能够形成功能性突触。另一方面神经干细胞系的建立解决了胚胎移植的供体来源问题，同时也避免了伦理学方面的争论。目前使用不同方法、不同动物模型、不同神经干细胞系进行研究，发现无论是诱导神经元突起发芽，逆转神经元萎缩，运输和替代分泌一些因子(包括代谢酶、神经递质、神经营养因子、细胞毒性因子、病毒载体和髓磷脂等)，改善损伤有关的和年龄相关的认知障碍，纠正代谢及神经病理产生的紊乱，还是抵抗兴奋毒性和缺血损伤神经元变性引起的损伤都可以利用神经干细胞来实现。神经干细胞还可以作为基因治疗的载体，表达治疗性因子以维持细胞存活和促进轴突再生。因此转基因神经干细胞移植也是今后脊髓再生研究的一个新的方向。
嗅粘膜处的神经元是惟一出生后再发育的神经元，并在整个生命过程中保持着分化的能力。神经元的轴突从粘膜生长入嗅球是一种特殊的胶质细胞在起作用。这些特殊的髓鞘细胞具有雪旺氏细胞和星形胶质细胞的特点，它们并不像雪旺氏细胞仅局限在外周神经系统。嗅鞘细胞可伴随着嗅轴突长入中构神经系统，它们可为轴突的生长提供正确的方向，是惟一能穿越外周神经系统和中枢神经系统的胶质细胞。OECs在其膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子，并能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子。Anthony等通过数字时间成像发现，移植早期，OECs显示了快速且多样的形变能力，而同种环境下的其他神经细胞的形态相当稳定。提示OECs能适时地改变自身形态以适应复杂的微环境。毫无疑问，嗅鞘细胞的这些特性为神经再生建立了良好的微环境。1997年LI报告了应用从成年鼠嗅球中分离培养的OECs可促进皮质脊髓束的再生和分化，轴突可穿过损伤区长入去神经的尾侧传导束，OECs可围绕单一的轴突形成髓鞘，也可包围一组轴突形成束。沈慧勇等在国内率先进行了OECs移植修复脊髓损伤的系列研究，证实当OECs被移植入成年鼠的脊髓损伤区内，它们能与宿主神经实体组织结合为一体，诱导再生轴突穿过抑制屏障长入远端。特别值得一提的是，在大鼠动物模型组织学检查发现，与移植Schwann细胞比较，移植OECs长入脊髓远端的能力更强，可在损伤区形成连续的桥接，恢复动物的部分功能。Guest、Bemal 2002年证实猪、灵长类动物OECs有着同大鼠OECs相似的特性，为临床应用自体移植修复脊髓损伤奠定了初步的实验基础。
四、基因治疗
基因治疗SCI尚处于实验阶段。目前转入的基因主要是NTF或其受体，受体细胞主要是SC、成纤维细胞、肌细胞、胶质细胞等。腺病毒是基因治疗中较为理想的载体，因具有宿主广泛，能感染各种分裂期和非分裂期细胞，插入外源基因容量大，相对安全和稳定等特点，近来倍受关注。Tuszynski等国外学者采用NTFs基因修饰成纤维细胞或SC细胞后再将其植入大鼠的脊髓损伤区，观察到其对轴突的保护和再生作用。鲁凯伍等通过阳离子脂质体介导将胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因转染至脊髓损伤局部，观察到了GDNF基因高表达具有神经损伤保护作用。杨浩等将人睫状神经营养因子(hCNTF)经逆转录病毒载体转染OECs，发现其对神经元存活和轴突生长具有显着的促进作用。
基因治疗目前还存在一些尚待解决的问题。首先是宿主移植细胞的免疫排斥。尽管CNS的免疫应答能力微弱，但对抗原较强的或种属相关较远的受体细胞，仍具有免疫排斥反应。因此，最好使用自体工程细胞移植。其次是遗传修饰细胞移植后转移基因的表达可能会随着时间的延长而逐渐下降，以致失去其治疗作用。故而利用内源性或外源性调节因子主动调节转移基因的表达极为重要。国外最近报道用基因修饰腺病毒治疗的一个青年患者死亡，对病毒修饰基因治疗安全提出了新的问题。此外，持久性转基因表达和外源基因针对特定组织的特异导向性问题尚需解决。随着分子生物学的发展，人类基因工程组计划的完成，我们可以实现把有丝分裂促进剂的基因插入人神经元的基因，从而使脊髓神经元像外周神经元那样具有生长愈合能力。截瘫患者重新站起来的愿望将有可能成为现实。
五、脊髓白质中的抑制因子
发育成熟的脊髓组织中存在着阻碍神经再生的抑制因子，而脊髓白质所富含的髓磷脂更是起着非常重要的作用。髓磷脂主要存在于少突胶质细胞中，后者构成脊髓轴突的髓鞘。Caroni P等于1988年首次报告中枢神经内(主要是少突胶质细胞)存在抑制因子，并发现单克隆抗体IN－1可以阻断其抑制作用。最近，这种可以用IN－1抗体识别的抑制因子基因已被成功克隆，并命名为Nogo。Nogo在少突胶质细胞上高度表达，其基因可分为3个明确的蛋白片段，即Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，Nogo－A起主要的抑制作用。有人将mAb-IN－1注入脊髓半横断动物的脑脊液中，以拮抗Nogo-A的抑制作用，发现再生的皮质脊髓束可以越过脊髓中线，长入失神经的远侧脊髓，神经功能也有满意的恢复。Olivier R等认为，Nogo-A在整个抑制活动中，起总的调节作用，消除Nogo-A的影响，脊髓组织将退回到未发育成熟状态。由此可见，消除或拮抗影响再生的抑制因素，已成为脊髓损伤修复中一个不容忽视的重要环节。另外还有一些抑制因子如髓鞘相关糖蛋白(MAG)、蛋白多糖(CSPG)、Ompg，semaphorin和ephrin家族等，它们存在于髓鞘、少突胶质细胞、形成瘢痕的细胞和胞外基质。这些分子均能诱导生长锥塌陷，从而导致轴突再生流产。值得指出的是用抗体阻断任意分子的作用可部分地改善功能恢复，但并未观察到明显的再生效应，究其原因是由于抑制物的多样性。因此阐明这些抑制分子产生作用的信号机制并寻找其共同的作用靶分子成为近年来神经生物学研究的热点之一。目前为止，抑制分子的干预主要包括以下方面：
(一)抗体中和抑制分子
拮抗Nogo产生的抗体已用于临床脊髓损伤的模型。抗Nogo抗体IN－1的杂交瘤移植到大树侧脑室附近，继而对大鼠行脊髓半切术，发现皮质脊髓的轴突向半切术部位长出几毫米，对照组大鼠则没有表现再生。另外，用IN－1处理可引起未损轴突的侧枝发芽增加。MAG抗体在体外能中和其生长抑制作用。由于Nogo、MAG和Ompg在生长抑制活动中可能作用于同一受体，所以任何这些分子的存在都对再生产生巨大的抑制作用。胶质瘢痕的存在是再生过程中的一个主要的物理和化学屏障，因此对瘢痕的处理也一直是脊髓损伤研究的重要课题。现已明确的来源于胶质瘢痕的抑制分子有蛋白多糖、细胞粘合素、semaphorinⅢ和NG2等。近年来，发现瘢痕中含有硫酸软骨素——CSPGs。一个被广泛支持的观点是CSPGs是瘢痕中抑制轴突再生的关键分子。目前研究最多的是硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)，在离体条件下，用中和抗体可除去其抑制效应。Fawcett和同事们测试了软骨素酶ABC对受损的黑质纹状路径及脊髓中轴突再生的功效：用IN－1处理大鼠后再生性皮质脊髓束纤维可伸展10～20mm；用软骨素酶处理与用IN－1处理相比较，前者纤维生长距离更短。需要指出的是，除了用抗体来中和轴突生长抑制分子外，直接对抗磷脂表面抗原的抗体联合血清补体也已经被用于脊髓损伤后诱导快速的磷脂分裂和清除，以消除磷脂对轴突生长的抑制作用。
(二)Nogo受体成为克服中枢神经系统轴突再生的新的干预靶及其干预措施
本世纪初，耶鲁大学的科学家发现并克隆了Nogo-A的受体——Nogo－66受体(NgR)，是具有472个氨基酸的膜蛋白，主要在中枢神经系统中表达并且在神经元损伤后表达上调。NgR本身无信号转导能力，其下游分子的激活需要协受体或协受体复合物的参与。最近研究表明，不仅Nogo-A，而且MAG和Ompg亦能与NgR特异性地结合并具有与Nogo－66相近的kD值。Wang等以Ompg的融合蛋白作为探针，用表达克隆策略在细胞表面明确了Ompg结合蛋白，序列分析和共沉淀证实该蛋白为NgR。突变分析的结果显示NgR的LRR和LRRCT位点介导Ompg的抑制效应，表明NgR是Ompg的抑制活动的必需的信号转导子，Ompg是NgR的一个生理配体。两个实验室几乎同时报道了MAG是NgR的功能性配体：他们用不同的方法，在多种神经元培养模型上证实MAG与NgR结合能抑制突起的生长，抑制作用可被NgR的显性失活负突变体所阻断。NgR的竞争性阻断剂NEP1－40并不阻断MAG的效应，Nogo－66和Ompg均可与MAG竞争性地结合NgR，并产生更强烈的协同性抑制，说明3种髓磷脂抑制物与NgR的结合位点不尽相同，但是均能导致生长锥塌陷，从而使轴突的再生受到抑制。虽然存在多种抑制物，但它们均独立地通过NgR产生抑制作用。这种信号的汇聚，使得NgR成为克服再生抑制的一个新的干预靶。
GrandPre等尝试了用竞争性短肽NEP1－40来拮抗NgR的作用，结果显示NEP1－40可翻转Nogo66诱导的突起生长抑制，但对除Nogo－66外的其他髓磷脂抑制物的效应不敏感，使其在体内的效果并不十分理想，表明该短肽并不能封闭NgR所有与抑制分子结合的位点。要达到彻底抑制NgR的作用，要另辟蹊径：用可溶性的NgR来稀释再生神经元细胞膜的NgR的作用，亦产生了明显的拮抗髓磷脂抑制和促进再生的作用。但该分子在损伤局部的应用，同中和抗体一样，引起扩散受限和易于降解，而妨碍了其在临床的治疗前景。最近运用基因敲除小鼠和突变缺失技术发现p75NTR通过其细胞外区与NgR碳末端的结合可介导髓磷脂的抑制再生效应，并不被神经营养因子的应用所阻断，表明p75NTR作为NgR的一个协受体，可能通过增强RhoA(一种与细胞骨架调节有关的GTP酶)的活化介导髓磷脂抑制物对轴突再生的抑制。由于p75NTR在中枢神经系统发育和损伤后再生过程中的分子机制以及与NgR的相互作用特点尚不完全清楚，加上p75NTR生物功能的多样性，目前通过对p75NTR干预来克服再生抑制尚不现实。虽然通过抑制RhoA可有效地改善中枢神经系统损伤后的轴突再生，但由于NgR的下游信号机制尚未完全阐明，这种干预的真正效果及所用的抑制酶是否对正常的神经元和代偿可塑性的出现产生影响需要进一步验证。另外，抑制RhoA的C3抑制酶不能进入血－脑屏障，也不能自主进入神经元内发挥作用。因此应用受到限制。目前针对NgR的措施在不同程度上取得了一定的效果，随着NgR及其信号转导研究的不断深入，将会有更多的途径进行干预，但其前提是神经元必须存活。因此，这些策略尚需与神经保护手段协同，方能发挥最优效应。
(三)内在干预措施
脊髓损伤后诱导神经元再生潜在的另一种方法是改变神经元内在再生状态，使抑制分子不能作出反应。这种信号分子经大量研究检测，主要是内在的cAMP和Rho。
(1)提高cAMP：两个最近的研究评价了是否增加体内cAMP水平能促进成年哺乳动物中枢神经系统内轴突的再生。这两个研究都发现，膜透过性cAMP同功异质体双丁酰环磷酰苷(db-cAMP)在背侧柱损害前注入成年大鼠DGR，发现被横断的感觉性轴突的再生增加。这两项研究对我们理解体内中枢神经系统损伤后影响轴突再生的胞内信号提供了一个新的观念。系统性地给予能提高神经元cAMP水平到足够高以刺激再生的因子，当cAMP激活许多路径时也许可以导致未预期的副作用。另外cAMP水平的增加可能改变生长轴突对引导提示的反应，导致产生错接。如果cAMP介导的对轴突生长和生长锥引导的作用能被分离，这种副作用就可以被避免。Cai等最近的研究提示这是可能的。他们发现在体外，cAMP和神经营养因子介导的髓磷脂上轴突生长的增加需要精氨酸酶的表达和多胺合成。有学者认为cAMP可能是神经生长因子信号通路整合的下游成分。因此，增加精氨酸酶Ⅰ的表达的方法或用多胺合成治疗也许可被发展为促进体内轴突再生的手段。
(2)失活Rho：对非神经元的体外研究以帮助建立起GTP酶的Rho家族对肌动蛋白－细胞骨架的作用和它们调节几种细胞反应的能力，包括形态、生长、迁徙、增殖、粘附、吞噬作用和基因转录。因为在轴突生长和引导中涉及肌动蛋白－细胞骨架，因此，在中枢神经再生的工作中对蛋白Rho家族的研究变得更为重要。神经元内GTP酶的一个基本作用是连接由配体细胞表面受体刺激的信号路径和生长锥中细胞骨架动力学调节的相互作用。Rho能够被C3转移酶特异性灭活，并且用这种酶处理可刺激体外抑制性底物上的轴突生长，如髓磷脂或CSPG。McKerracher等已经报道体内RhoA被C3灭活后，以纤维蛋白粘附方式传送，以促进成年小鼠脊髓背侧横切后皮质脊髓束轴突的远距离再生达12mm。C3已被显示可促进挤压伤后成年大鼠视神经的再生。阻滞Rho相关的激酶(ROK)——Rho的一种下游标靶。在促进轴突再生中效果欠佳。如果这些方法要作为治疗作用，就需要促进C3进入同时又不产生进一步的细胞损伤的方法。