无菌技术

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《果树育苗手册》第27页（2624字）

无菌技术的内容包括培养基、器皿、植物材料、接种工具的灭菌以及无菌操作技术。

1．培养基的灭菌 常用高温高压灭菌锅。常用电热或燃气加热。当锅内压力升至0．5千克／厘米²应打开排气阀排出锅内冷空气，或一直打开放气阀至冒出大量蒸汽，以排出锅内冷空气。然后关闭排气阀，压力继续上升至1．1千克／厘米²时，锅内的温度一般为120℃，保持15～20分钟即可。若灭菌时间过长，会使培养基中某些成分失效。切断热源后，可让灭菌锅自然冷却，或缓慢排气，使锅内压力接近于零，这时完全打开放气阀，排出剩余热气，取出培养基。冷却后应置于温度低于30℃的暗处备用。培养基放置的时间不宜过长，一般不要超过二三周。

2．特殊药品的灭菌 某些生长调节物质，如IAA、玉米素，及某些维生素如维生素C等遇热是不稳定的，因此不能进行高压灭菌，而需用过滤方法灭菌。过滤除菌是使溶液通过孔径为0．20～0．45微米的微孔滤膜，它可以防止菌类通过，以达到除菌的目的。过滤除菌法必须通过一定的压力使溶液快速通过。所用器皿事先均应灭菌。

3．器皿(具)灭菌 培养皿、漏斗、吸管等玻璃器具和解剖刀、接种针、镊子、剪刀等金属器具，均可用干热灭菌法。将清洗晾干后的器皿器具用牛皮纸包好，放进电热烘干箱。当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，以使电热烘干箱内温度均匀。当温度升至160℃时，定时控制1小时，达到灭菌目的。亦可用高压蒸汽灭菌锅灭菌。

4．外植体的灭菌 外植体在接种之前，需严格的灭菌。同时又要注意不至于损伤外植体。但不同植物及一株植物不同部位的组织，有其不同的特点，它们对不同种类、不同温度的消毒剂的敏感反应也不同。所以开始都要摸索试验，以达到最佳的消毒效果。

(1)常用消毒剂及其作用如下

①70%乙醇 具湿润和杀菌双重作用，浸渍15～30秒钟，再用以下杀菌剂杀菌。

②氯化汞(HgCl₂，升汞) 常用浓度0．1%，处理时间5～10分钟，杀菌效果好，但残毒高。消毒后需用无菌水冲洗3～5次。

③次氯酸钠 浓度可为0．5%～10%，时间5～30分钟，杀菌效果比较好，对植物无害。

④漂白粉 1%～10%的滤液，处理时间5～30分钟，杀菌效果很好，但应避光、干燥保存。

⑤过氧化氢 浓度为3%～10%，处理时间5～10分钟，杀菌效果好。

(2)常见外植体的消毒方法如下

①茎尖、茎段及叶片等的消毒 植物的茎、叶多暴露于空气中，有的本身具有较多的茸毛、油脂、蜡质和刺等，又在田间受到泥土、肥料及杂菌的污染，所以消毒前要经自来水较长时间的冲洗，特别是一些多年生的木本植物材料更要注意，有的可用肥皂、洗衣粉或吐温等进行洗涤。消毒时先以70%酒精浸泡数秒钟，以无菌水冲洗2～3次，然后按材料的老、嫩及枝条的坚实程度，分别采用2%～10%的次氯酸钠溶液浸泡10～15分钟，再用无菌水冲洗3次后接种。

②果实及种子的消毒 根据清洁程度，用自来水冲洗10～20分钟，再用纯酒精迅速漂洗一下。果实先用2%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗2～3次，就可取出果内的种子或组织进行培养。种子则先要用10%次氯酸钙浸泡20～30分钟，甚至几小时，依种皮硬度而定。难以消毒的还可用10%升汞或1%～2%溴水消毒5分钟。进行胚或胚乳培养，对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%～8%的次氯酸钠溶液浸泡8～10分钟，经无菌水冲洗后，即可取出接种。

③花药的消毒 用于培养的花药一般未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。一般用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2～3次，再在漂白粉滤液中浸泡10分钟，经无菌水冲洗2～3次即可接种。

④根及地下器官的消毒 这类材料生长于土中，消毒较为困难。除预先用自来水洗涤外，还应用软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，用吸水纸吸干后，再用纯酒精漂洗。采用0．1%～0．2%升汞浸5～10分钟或2%次氯酸钠溶液浸泡10～15分钟，然后用无菌水冲洗3次，用无菌滤液吸干水后可接种。上述方法仍不见效时，可将材料浸入消毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液的渗入，从而达到彻底灭菌的目的。

5．无菌操作技术 污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子，因此首先要做好接种室的消毒。每次接种前进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气的灰尘沉降。在操作前20分钟先使超净工作台处于工作状态，让过滤空气吹拂工作台面及四周台壁，并以紫外灯照射。工作台面要用酒精擦洗。使用超净工作台对接种环境污染控制最有成效。但它应放置在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。

工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行高压灭菌。在操作前工作人员应穿戴好衣帽，需剪除指甲，并用肥皂擦洗，在工作台上用70%酒精擦拭双手。在操作时应禁止谈话并戴上口罩。接种时必须在火焰处打开容器的塞或盖子，并使瓶倾斜，以免空气中的微生物落入瓶中。整个接种工作应始终在火焰处进行。接种完后，立即盖好瓶口。发现污染的材料应及时处理，对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌后，接入新鲜的培养基中重新培养。

对于污染培养瓶在未打开瓶盖之前，把所有的污染瓶集中起来进行高压灭菌后，把污物清除掉，再把瓶洗净后备用。