非需氧菌(包括微需氧菌、厌氧菌)的培养

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第72页（2715字）

一、微需氧菌培养法

1．将接种后的培养基置标本缸或玻璃干燥器内，缸盖及缸口分别涂上凡士林。

2．缸中放一段点燃的蜡烛，立即盖紧缸盖至蜡烛自行熄灭(此时缸中含5～10%的CO₂气体)。连同缸置温箱培养。一般微需氧菌在24～48h即可长出可见菌落。

二、厌氧菌培养法

(一)疱肉基培养法 将培养基表面的凡士林或固体石蜡稍加热溶化，倾斜试管片刻，使凡士林或固体石蜡粘附于管壁，然后接种(接种法同液体培养基接种)。接种后又置火焰上微微加热溶化管壁上的凡士林或固体石蜡，使之覆盖于培养基表面，待凝固后置温箱培养。也可于培养基表面加一定量的液体石蜡，接种时倾歪试管接种。

若作厌氧芽孢菌的分离，接种后可将培养基置80～85℃水浴中加热10min，再置温箱培养2～4天观察结果。

(二)共栖培养法 厌氧菌与需氧菌同培养于一平皿内，需氧菌(常用蜡样芽胞杆菌)生长将氧耗尽，厌氧菌即可生长。

方法：用共栖培养皿或将平板培养基中央切除一小条形成两块培地，分别将需氧菌和厌氧菌接种于培养基上，并将培养皿倒扣于一玻板上，用蜡封闭，置温箱培养。

(三)焦性没食子酸法 焦性没食子酸在碱性溶液内能吸收氧气，造成厌氧环境。反应式如下：

100cm³空间用焦性没食子酸1g，6%NaOH或10%NaOH1ml(造成碱性环境)即可。

1．平皿法

(1)取一小团直径约2cm的脱脂棉或多层滤纸，置于平皿盖或玻璃板中央，同时准备好溶化的石蜡及滴石蜡的吸管。

(2)将被检样品接种琼脂平皿。

(3)滴加6%NaOH(或10%KOH)溶液0．6ml，浸于脱脂棉或滤纸上；在靠近脱脂棉(或滤纸)处放置焦性没食子酸0．6g(两者暂勿接触)。

(4)立即将刚接种的培养皿扣在有脱脂棉(或滤纸)和焦性没食子酸的平皿或玻板上。迅速将四周用石蜡或胶布封闭。

(5)轻轻摇动平皿(或玻板)，使被NaOH(或KOH)液浸湿的脱脂棉(或滤纸)与焦性没食子酸接触。置温箱培养24～48h观察结果。

2．干燥器培养法

(1)按上比例取10%NaOH(或10%KOH)液置于干燥器底部，然后放置2～3个略高于液面的玻璃圆柱(如链霉素瓶)，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上(暂勿与NaOH或KOH接触)。

(2)放上隔板，将接种完毕的培养基放置隔板上，同时放美蓝指示剂一管。

(3)盖上缸盖并用石蜡或凡士林封闭。

(4)轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉入NaOH(或KOH)溶液中，反应后，干燥器内若无氧，美蓝指示剂由蓝变白。

(5)置温箱培养24～48h观察结果。

附 美蓝指示剂的配制

成分：0．1mol／LNaOH溶液0．6ml，加蒸馏水10ml0．5%美蓝水溶液0．3m1，加蒸馏水10ml葡萄糖0．6g，加蒸馏水10ml。

配法：将以上三种成分配好后，取等量混合即成。使用时装入试管，置水浴中煮沸，除去液体中的游离氧(原为蓝色，除氧后液体呈无色)，立即放入厌氧缸中。该指示剂新配为好。

(四)碳酸氢钠一盐酸(NaHCO₃一HCl)法

1．将接种后的培养基置标本缸或玻璃干燥器内，缸盖及缸口涂上凡士林。

2．按每升容积加NaOH0．4g和浓HCl0．35ml的比例，分别取两成分置同一平皿内(先勿使两成分接触)，放入标本缸或玻璃干燥器内，盖紧缸盖使之密闭，稍倾斜容器使NaHCO₃与HCl混合，反应后产生CO₂。连同缸一起置温箱培养。

(五)厌氧袋法

1．将接种的平皿、试管装入特制的塑料袋中(塑料袋要求无毒、透明、耐酸碱)。

2．约装2000ml容积的塑料袋，取硼氢化钾(KBH₄)0．3g，碳酸氢钠(NaHCO₃)0．7g装入试管，取25%柠檬酸(C₆H₆O₇)2ml装入塑料眼药水瓶中，并插入装有KBH₄和NaHCO₃的试管口(严格厌氧菌的培养可按比例适当增加上述药物)。连同试管放入袋中，同时放5～10粒钯粒于另一试管，装入袋中。

3．封紧袋口，压迫塑料眼药瓶，使C₆H₈O₇液流入试管与其他两成分混合并发生反应。反应完全后，袋内约含80%N₂，10%CO₂，5%O₂，5%H₂，在钯的催化下，H₂与袋中残余O₂发生反应结合成H₂O，使袋内呈无氧状态。

4．送温箱培养24～48h观察结果。

(六)厌氧缸法

1．将接种后的平皿或试管置特制的厌氧缸或真空干燥器内，并将有适量粑粒的平皿放入厌氧缸中，盖好缸盖并密闭。

2．用真空泵抽出空气至真空；充入N₂，再抽真空，反复进行3次。

3．最后一次抽至真空后，充入含10%H₂，10%CO₂，和80%N₂气体。置温箱培养24～48h观察结果。