免疫荧光技术
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第159页（7802字）
免疫荧光技术是利用荧光素标记抗体，对被检材料进行荧光染色，借助荧光显微镜对相应抗原进行示踪定位。
从染色方法上分有直接法和间接法两种，此外，还有少用的补体法和用于定量免疫荧光的限量底物珠、均相免疫荧光测定等方法，主要用于细菌、病毒和其它病原体的快速诊断，病毒抗原的定位和细胞表面抗原的检测。间接荧光法还可用于抗体的检测。
一、常用的荧光素
1．异硫氰酸荧光素(FITC) 最大吸收光波长为490nm，与抗体结合后，则为495nm，最大发射光波长为525nm，呈草绿色荧光，荧光效率高。
2．罗丹明荧光素(RB200)主要为异硫氰四甲基罗丹明(TMRITC)(ISOMER R异型分子R)最大吸收光波长为554nm，最大发射光波长为620nm，呈桔红色荧光，易与组织自发绿色荧光相区别。荧光效率为25%，猝灭慢。由于以上两种荧光素的发射光波长差别较大，颜色不同，因而，二者可以进行双重染色，对同一标本中不同抗原进行测定。
荧光素分子上的异硫氰酸(FITC)和磺酸基(罗丹明)可以通过共价键，结合到抗体分子上，这一反应在碱性条件下(pH9．5以上)完成。结合了的荧光素与游离的、未结合的荧光素，通过分子筛很容易分开，故易于制备标记抗体。用于标记荧光素的抗体应具有高度特异性和较高的亲和力。
二、免疫球蛋白提纯
由于血清中的白蛋白、α-球蛋白和β-球蛋白与荧光素的结合力比免疫球蛋白的结合力强，何况这些蛋白质所带负电较多，标记后，易通过静电作用与组织发生非特异性反应，故必须用提纯抗体进行标记。
1．盐析法粗提 抗血清先用生理盐水稀释一倍，边搅拌边滴加等体积的饱和硫酸铵溶液(到达50%饱和)，置4℃下，静置30min，4000rpm离心40min，弃上清，沉淀用等积的生理盐水溶解后，边搅拌边加入
容积的饱和硫酸铵溶液(33%饱和)，置4℃下30min，4000rpm离心40min，弃上清，将沉淀重新溶解，如此重复3次，将沉淀溶于少量生理盐水中，装入透析袋，置生理盐水中透析2～3天，每天换液数次，直至无铵离子或硫酸根离子。此粗提的IgG即可用于标记。
2．层析法纯化 上述制备的免疫球蛋白，可以通过葡聚糖G-200(Sephadex G-200)或DEAE-纤维素离子交换层析进一步纯化。
Sephadex G-200凝胶过滤方法如下。
预先将Sephadex G-200用蒸馏水浸泡3天，使其充分膨胀形成凝胶，将其装入2×50cm或2×100cm的玻璃层析管内，调节静水压为20cmH2O(1)，流速为5ml／15min，待凝胶沉淀后，用0．01ml PBS(pH7．2)平衡达1h，加样量与凝胶之比为1∶20。待柱上液体剩下至一个硬币厚时锁住下口。沿管壁加入粗制免疫球蛋白溶液(先在PBS中透析平衡)，当样全部进入凝胶后，轻轻在凝胶柱上部加入PBS进行洗脱，部分自动或人工收集下口流出液，每部分收集液均用20%磺基水杨酸检测蛋白质的出现，并用紫外光分光光度计测定260nm和280nm处各部分的吸光度值(A)。描记洗脱曲线，在洗脱曲线上，IgM在第一峰，但量少，IgG在第二峰，浓度高。
将含IgG的各部分合并，以聚乙二醇(PEG)6000或超滤浓缩至原体积，并根据公式计算蛋白质含量。
三、荧光抗体制备
1．FITC标记 FITC在碱性水溶液中(pH9．0～9．5)容易与抗体结合，标记程度(F∶P比值(2))受反应时间和温度的影响。4℃下作用18h其效果与20～25℃室温下作用1h相似。
方法一：称取FITC结晶型粉末(Ⅰ型)，用少量0．025mol／L碳酸盐缓冲液(CB pH9．0～9．5)溶解。FITC与抗体的比值为每mg IgG中加15～20μgFITC。溶解后，迅速加入抗体液(pH9．0～9．5)中，充分混合，混合液中蛋白质含量不应低于20mg／ml。用0．1mol／L CB调整pH3．95，然后置于4℃下搅拌12～18h，经Sephadex G-25凝胶过滤除去未结合的荧光素。
方法二：IgG含量越高，标记后结合的F∶P比值越大。因此，用高蛋白含量的IgG溶液进行标记可以获得满意的效果。
FITC(1mg／ml)溶于0．15mol／L Na2HPO4(pH9．0)溶液中，按100mg抗体溶液中加入1ml FITC溶液与抗体溶液(至少不低于25mg／ml)混合，用0．10mol／L Na2HPO4·12H2O调节pH至9．5，置室温下搅拌，维持60分钟，经Sephadex G-25除去游离荧光素。
2．RB200标记 常用的是异硫氰α甲基罗丹明(TMRITC)。要求在低蛋白含量(4mg／ml)下进行，罗丹明与蛋白含量比例为每mg IgG加30μg无定型粉末或12．5μg纯结晶。无定型粉末的反应条件为冰溶作用1h，再在0℃作用18h，游离色素必需通过阴离子交换层析方法可纯化。
3．荧光抗体的纯化
(1)层析法纯化 在20×1cm的层析柱内，加入已膨胀的Sephadex G-25或G-50，去掉上层过量溶液，再加凝胶使柱床长为16cm，在柱床表面加上一张中为1cm的滤纸片。用0．01mol／L PBS(pH7．2)平衡1或2小时后，在表面滴加标记物溶液，并用PBS进行洗脱。收集第一含色素峰，此即为荧光抗体，通过此法，可以去掉未反应的荧光色素。
(2)沉淀法纯化 用50%饱和硫酸铵或18%Na2SO4盐析一次经4000rpm离心20min，取沉淀，用少量生理盐水将沉淀溶解，并对生理盐水透析24h。
(3)荧光抗体鉴定 荧光抗体的质量标准有理化特性、反应特征等。
理化特性鉴定：主要有荧光色素(F)和蛋白质(P)的比值，它反映了标记率的高低。通过对结合物中荧光素和蛋白质含量测定，即可计算出F／P的比值。用于病毒抗原定位时，F／P比值以1．0～1．5为宜。一般实验室可不做理化鉴定。
免疫学特性鉴定包括特异性和最佳工作浓度等的测定。
①染色滴度的测定 以倍比稀释的荧光抗体与标准阳性标本作系列染色，出现明亮荧光的最大稀释倍数，即为该结合物的特异性染色滴度，同时以不含抗原的阴性对照测定非特异性染色滴度，实际应用时应取低于特异性染色而高于非特异性染色的滴度的稀释度，如特异性滴度为1∶64，非特异性滴度为1∶8，则该试剂的工作浓度以1∶32为合适。
②特异性鉴定 通常以抑制试验和吸收试验以鉴定其特异性，吸收试验是在荧光抗体中加入过量的对应抗原，然后以此染阳性标本，应无明显荧光。抑制试验是将标本先用未标记的抗血清作预处理，再用荧光抗体染色，结果反应应被抑制，荧光强度降低或消失。
四、标本制备
染色标本的制备方法随材料类型而异，主要有切片法包括冰冻切片和石蜡切片，组织培养小盖玻片及组织压、印片等。
1．冰冻切片和石蜡切片 保证冷台与冷刀温度适中，是切好切片的关键之一。温度太低，组织切片易碎裂，温度过高，也切不好。因此，温度以-20～-30℃为宜。此外，组织块要小，约3mm见方，切片刀锋利。切片厚度要求在4～6μm之间，超过6μm时，自发荧光增强，视野模糊。操作时，预先使冷台、冷刀制冷，达-25℃左右，然后将新鲜速冷处理过的组织块用少量浆糊或生理盐水溶于组织块底部，使其与冷台接触，粘牢，调节切片厚度，切好的组织片贴于洁净的载玻片上，并用电吹风器冷风吹干(20～30min)，即可进入固定液。冰冻切片的优点是能保证组织内抗原最大程度地免疫活性。但因冻融后使结构破坏，背景荧光较强。
2．涂片、压印片 这是快速诊断时的常用方法。用快刀片切除动物脏器(肝、脾、淋巴结、肾等)小块，切面整齐。用滤纸将切面污血吸净，将组织块压印或涂于载玻片上即可。此法可用于脏器、血液、细菌培养物及其他体细胞悬液中抗原或抗体的染色分析。
3．组织培养物 对于组织培养物中病毒抗原的鉴定所用的荧光抗体染色，多采用小盖玻片法，在分装细胞时，预先将灭菌无毒的小盖(1／3盖玻片)放入组织培养瓶内，使细胞长成单层。接毒后经一定时间培养，用Hanks液或PBS(0．01mol／LpH7．2～7．4)，洗净3次后即可进行固定染色。亦可在聚苯乙烯微孔板上作微量细胞培养，培养病毒直接在板上固定，染色观察，效果很好。
4．固定 固定的目的是防止标本脱落，除去脂类以利抗原-抗体结合和降低本底荧光。固定剂与固定条件应根据被对象而定。常用的固定剂有丙酮、乙醇、甲醇、四氯化碳、甲醛和戊二醛。最常用的固定剂为丙酮和75%乙醇，固定温度和时间要凭反应效果而定，一般病毒和细菌抗原用室温5～10min或4℃30min，某些病毒最好用冷丙酮-20℃固定60min，固定后旋即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。
五、荧光抗体染色技术
荧光抗体染色技术分三大类，即直接法、间接法和补体法。在实际研究中，又以前二类多用。直接法的操作程序如下。
1．将固定的标本置于PBS(0．01mol／L PBS0．15mol／L，NaClpH7．2～7．4)中洗浸3次，每次3min，习惯上是通过三杯PBS液，最后至蒸馏水中5～10min脱盐。
2．将标本于室温中空气干燥或用吸水纸印干。
3．于标本上滴加适量最佳工作浓度的荧光抗体，置湿盒中(37℃)作用30min。
4．用PBS将荧光抗体溶液轻轻冲洗后，将其通过三杯PBS溶液，整个(1～4)过程1～2h内完成，用吸水纸吸干。
5．封片。将磷酸甘油液(9份甘油+1份0．01mol／L PBS)滴在标本上，轻轻盖上一片洁净的盖玻片。
直接法应设立标准阳性标本对照，阴性标本对照，必要时还需做抑制试验，以确证其特异性。直接染色法特异性高，操作简单快速，适于快速诊断。
间接法是先用未标记的抗血清处理，然后再加荧光素标记的第二抗体染色。近几年来已出现了多种二抗替代物如金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)和生物素-亲和素系统等，均可用荧光素标记进行间接染色。
六、荧光显微镜检查
1．荧光显微镜 荧光显微镜是荧光抗体染色的必备工具，它与普通光学显微镜的差别是增设了紫外或近似于紫外光源及其特殊光路系统，其作用是将带有荧光染料标本，在紫外光或近似紫外光源的照射下，使之发出荧光，并通过物镜、目镜等系统放大，在物镜和目镜之间有保护镜，便于实验者观察。
荧光显微镜系统主要有光源及灯室、激发滤光片、反射镜与聚光器、屏障滤光板等，其它部件同普通光学显微镜。
(1)光源 在为超高压汞灯100W及200W，代号为HBD100和HBD200，发射波长为280～600nm，其主要发射峰在365nm及435nm，在546nm处也有较强的发射峰，呈紫外光、蓝绿光及绿光，这些波长适应于常用荧光色素的激化。
(2)激发滤光片 主要有二种，一是紫外滤光片(简称UG)，主要通过300～400nm的光，其最大透光波长为365nm，代号有UG1～UG5等，另一种是蓝紫光滤光片(简称BG)，主要通过330～480nm的光，其最大透光波长为410nm，代号有BG12、BG13等。
(3)屏障滤光片 为黄色玻璃滤片，安放在目镜内，它可把400nm左右的光线遮住以保护观察者的视力，只许500nm以上的光波射入眼内，代号有OG、GG等。
用FITC标记抗体染色标本在镜检时，激发滤光片可用BG1或BG12与UG合用，并配以OG4或GG1屏障滤光片，用RB200标记抗体染色时，则用BG12与OG5相配，结果FITC荧光为草绿光，RB200为橙红色。
2．荧光显微镜的使用 荧光显微镜应安装在干燥、平稳的工作台上，避免光线直射，使用时，应保持环境黑暗，电源供应恒定。因此，应配备稳压装置，点灯后10～15min可达到最大亮度，即可观察，观察时，首先用玻璃笔(或荧光笔)将标本圈好，由低倍向高倍逐步放大观察，如用油镜(带红色圈记号)应使用无自发荧光的优质浸没油(Immersionoil)，每次用灯应在2h内结束，如需要再启动，至少需在关灯后15～30min进行，一个汞灯泡的最高使用寿命为200h，因此平时应坚持记录。
荧光染色标本应越薄越好，光照在标本上。超过一定时间(1～3min)会使荧光猝灭、减弱，停止观察时应关闭光门，照像时，应选择高速快敏感光胶卷，常选用35mm，24～29DIN胶片，如用常规35mm100A胶片，由于其感光性能低，每次曝光至少需5～30min。
七、猪瘟荧光抗体检查(应用举例)
本法主要用于检出白细胞涂片和脏器压片中的猪瘟病毒抗原，可作为猪瘟生前诊断和宰后检验之用。
(一)材料准备
1．猪瘟荧光抗体 用猪瘟病毒免疫猪后制备抗猪瘟高免血清。以硫酸铵盐析和DEAE纤维素柱层析提取IgG，以FITC标记猪瘟IgG。结合物经纯化测定最佳使用浓度，分装小瓶，置-30℃以下冰箱冷冻保存。有效期半年，切忌反复冻融。
2．pH7．2、0．015mol／L PBS液
0．5mol／L KH2PO4 26．4ml
0．5mol／L Na2HPO4 57．8ml
NaCl 7．10g
加蒸馏水至 842ml
3．丙酮-乙醇固定液 4份丙酮加6份无水酒精。
4．缓冲甘油 纯甘油9份加上述PBS 1份，混合后分装小瓶。
5．器材 荧光显微镜、玻片等。
(二)操作方法
1．标本片制作
(1)白细胞涂片的制作 由颈静脉或耳静脉采血2～5ml，立即注入含有1ml、3．8%柠檬酸钠溶液的管内混匀后，室温3～4h，吸上含白细胞的血浆部分，以2000r／min，离心10min，去上清，沉淀白细胞用5～10倍体积的0．83%氯化铵溶液(用pH7．4，0．015mol／L的Tris-HCl缓冲液配制)处理30min，使残留红细胞裂解。以2000r／min离心5～10min，去上清。再用氯化铵溶液处理一次。最后得到的白细胞沉淀物。用生理盐水洗2～3次，然后用生理盐水将白细胞稀释成适当浓度，滴1小滴于清洁载玻片上，做成涂片。涂片不宜过厚，空气干燥或吹干后，立即用于置4℃的丙酮-乙醇固定液固定10min，干后备用。
(2)脏器压片的制作 取待检猪脾和肾，去净结缔组织和脂肪，在清洁载玻片上做成横切压片，空干后，用丙酮-乙醇固定10min，干后备用。
2．标本片干后，至于蒸馏水中浸泡10min，用PBS洗3次。
3．于玻片上滴加1个工作浓度的荧光抗体，于湿盒中37℃作用30min。
4．用PBS洗涤3次。
5．干后用缓冲甘油封载，置荧光显微镜下观察结果。
6．制备标本的载玻片宜薄，应无色透明。涂片也要薄些，太厚不利观察，发出荧光也不亮。
7．标本检查时如需用油镜，可用无荧光镜油、液体石蜡或缓冲甘油代替柏木油，放载玻片时，需先在聚光器镜面上加1滴缓冲甘油，以防光束散射。
8．标本涂布区可用红蜡笔划一记号，先以此对光，然后移入标本区观察。先用低倍镜找出需观察部分，再换高倍镜或油镜观察，在同一标本区不宜连续观察3min以上，以免荧光猝灭。
(三)结果判定 发现有亮绿色或黄绿色荧光细胞，轮廓清楚，胞浆着色，胞核不着色者为阳性。