分离培养

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第449页（2389字）

霉形体的培养要求苛刻，用水、器皿及各种成分需按组织培养那样严格要求。pH值和所含抑菌物质如醋酸铊，叠氮化钠，青霉素等份量要准确，过多则不易生长。被检材料中，若含霉形体太少，则应盲传三代，以增高其分离率。

一、培养基基础成分的配制与保存

1．Hartley氏牛心消化汤 3kg搅碎的牛心，加5L无离子水，在蒸气中加热至80℃，常加搅拌。另取5L水加入40g无水碳酸钠，并与热牛心汤混合，冷至45℃，边搅拌边加入胰抽提液⁽¹⁾及氯仿各100ml(或代之以胰酶，使胰酶最终浓度为0．1%)。置45℃水浴3h或37℃6h，偶加搅拌。后除去液面全部脂肪，边搅拌边加入80ml浓盐酸，置于蒸气中15min，经粗滤纸过滤，冷至22℃时，用40%NaOH调节pH至8．0，115℃高压蒸气灭菌10min，贮存于4℃。

2．鲜酵母浸出汁

(1)水浸汁 取25g干燥酵母加水100ml，搅拌，置于37℃水浴20min，经115℃高压蒸气灭菌5min。容器的大小至少需为酵母悬液体积的10倍，以免溢出。冷却经4000rpm离心60 min，取上清液分装，115℃高压蒸气灭菌10min，贮于-20℃备用。

(2)酵母酸浸汁 500ml水预热至40℃，加入250g新鲜面包酵母，再加水500ml，用浓盐酸调节pH至4．6，加热至80℃持续20min，冷却后经4000rpm离心30min，取上清液经粗滤纸滤清，然后过滤除菌，分装，贮于-20℃中。

3．0．5%粘液素牛心汤 Hartley氏牛心汤1000ml加热至90℃，将5g粘液素和0．5g硅藻土(Celite)置于研钵中，加入适量预热牛心汤充分研磨后，静置片刻，吸取上清液收集至1000ml瓶中，再加预热的牛心汤重复研磨，至粘液素全部溶解为止。收集的上清液经粗滤纸过滤，115℃高压蒸气灭菌10min，贮于4℃中备用。

表19-1 分离猪、牛、羊、禽霉形体的培养基成分

注：a．高压蒸气系115℃10min，过滤用6号玻璃滤器b．除乳蛋白水解物溶解于Hanks液中以外，其余均用无离子蒸馏水配制。

4．血清 健康猪或马血清，或胎牛血清，必须灭活，唯配制尿素肉汤的胎牛血清不需灭活。

表19-2 分离猪、牛、羊、禽霉形体的液体培养基

*加精氨酸时免加葡萄糖，反之亦然；G^{* *}代表加葡萄糖的培养基，“A”代表加精氨酸的培养基，^{* *}用于初次分离时，以未经灭活的胎牛血清取代之则效果更佳。上述液体培养基如含琼脂，则为相应的固体培养基。

二、复合培养基的配方和制备

1．以Hartley氏牛心汤和HLH或Hank氏液为基础的复合培养基配方见表19-2。上述配方中加入0．9%琼脂糖或纯化琼脂(Difco或Oxoid L28)即成固体培养基。

2．制备方法

(1)液体培养基 Hartley氏牛心汤加HLH或Hank氏液，经6号玻璃滤器过滤，用无菌手续按配方加入其他成分，用1mol的NaOH或1mol的HCl调到表2所需pH值，粘液素牛心汤因其粘度较大，不易过滤，必须无菌操作。

在A26液体培养基中加入5%抗猪鼻霉形体抗血清(效价为代谢抑制试验1∶80以上)配成选择培养基，有助于从混有猪鼻霉形体的标本中分离出猪肺炎霉形体。

(2)固体培养基 在Hartley氏牛心汤与HLH混合液中，或在粘液素牛心汤中，加入0．9%琼脂糖或纯化琼脂，经115℃高压蒸气灭菌10min，冷至56℃，加入预热至同样温度的血清和其他附加成分，调正pH，倾注平皿，琼脂培养基厚度不少于4mm。

尿素肉汤培养基配制固体时，在Hartley氏牛心汤与Hank氏液混合物中加入1．2%HEPES(羟乙基哌嗪乙烷磺酸hydroxyethyl-Piperazine ethane-sulfonic acid)和0．9%琼脂糖混合，经115℃高压蒸气灭菌10min，加入配方中规定的其他成分，此外，还需增补1%L一半胱氨酸10ml和1%四次甲基二胺10ml。

3．不以牛心汤为基础的，经修改的Frey氏培养基用于分离培养禽源霉形体，基础液配法：NaCl2．5g；KCl0．2g；Mg₂SO₄·7H₂O0．1g；Na₂HPO₄0．8g；KH₂PO₄0．05g；葡萄糖5g，乳蛋白水解物2．5g，依次溶解于500ml水中，115℃高压灭菌20mni，4℃中保存。

完全培养基配法：基础液80ml、猪血清12ml，L一半胱氨酸(1%)1ml，辅酶I(1%)1ml，精氨酸(5%)0．12ml，醋酸铊(5%)0．5ml，酚红(1%)0．2ml。半胱氨酸与辅酶Ⅰ必须先混合，10min后再与其他成分混合，调pH至7．6。

固体培养基配法：在基础液中加入1%纯化琼脂，121℃高压蒸气中15min，冷至56℃时加入其他成分。