细胞培养液的配制
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第547页（8605字）
一、平衡盐溶液
在细胞培养中平衡盐溶液的应用很广，主要功能有三。
1．这些液体的渗透压与细胞相等，可作为营养液的稀释液和洗涤组织块和细胞悬液之用。
2．它们具有缓冲作用，使营养液的pH维持在生理范围内(pH=7．2～7．6)。
3．提供正常细胞代谢所需的水份和无机盐类，大多数平衡溶液还含有葡萄糖，可提供能量来源。
平衡盐溶液种类很多(表28-2)，常用的有下列数种：
(一)Hanks氏液——首先分别配制甲和乙两种原液
原液甲 NaCl 160g
KCl 8g
MgSO4·7H2O 2g
MgCl2·6H2O 2g
2．8%CaCl2 100ml
双蒸水 加至1000ml
先将固体成分加于800ml双蒸水中，加温到50～60℃加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1000ml。加氯仿2ml，摇匀后于4℃贮存。
原液乙 Na2HPO4·2H2O 1．2g
KH2PO4·2H2O 1．2g
葡萄糖 20g
0．4%酚红 100ml
双蒸水 加至1000ml
表28-2 各种平衡盐溶液的配方
将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2ml，摇匀后于4℃贮存。
Hanks氏工作液：
原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸水 18份
工作液分装100或500ml盐水瓶中用113℃高压蒸气(6×104Pa)灭菌10min，使用前以7%NaHCO3调节pH到7．2～7．6。
(二)Earle氏液 此液的配制步骤与Hanks相同。两液的用途基本一样，只是Earle氏液的缓冲作用较大，常用以配制维持液。
(三)Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7．3) 此液先配制甲、乙、丙三种原液。
原液甲 NaCl 80g
KCl 2g
KH2PO4 2g
Na2HPO4·2H2O 14．4g
双蒸水 800ml
原液乙 CaCl2 0．5g
双蒸水 500ml
原液丙 MgCl2·6H2O 1．0g
双蒸水 500ml
三种原液分别配制装瓶，用121℃高压蒸气灭菌15～20min。
工作液——取三液按下面比例用无菌操作混合。
甲液 80ml
乙液 100ml
丙液 100ml
双蒸水 720ml
此液广泛用于组织和细胞的洗涤，单纯甲液也常用于配制胰蛋白酶和EDTA溶液，因为不含Ca、Mg离子，细胞容易分散。
二、乳蛋白水解物(lactalbumin hydrolysate)
这是乳清蛋白经酶水解的产物，有商品出售，价格很便宜，可提供廉价的氨基酸和维生素，能满足多种细胞的生长需要。它可以作为单独的培养液，也可与其他培养液配合使用。它极易潮解，要保存于干燥器中。在细胞培养中应用0．5%的溶液，但一般先配成5%原液，临用前再稀释10倍。配制方法：用有盖秤量瓶秤取5g乳蛋白水解物，加于95ml Hanks氏液中摇振溶解，用115℃高压蒸气灭菌10min，此液很酸，临用前再以NaHCO3校正pH。此液在室温可保存一个月，最好贮存于-30℃，但在冻结后融化可形成沉淀，煮沸使其溶解，不会影响效果。
三、Eagle氏培养液
这是一种最简单但应用最广泛的综合培养液，大多数原代细胞和传代细胞系的生长都适用。除了Hanks氏液中的各种成分外，它含有13种氨基酸和9种维生素，类似培养液还有多种(表28-3)。
表28-3 Eagle氏培养液的各种成分(只列出氨基酸和维生素)
注：①配制时将上述成分溶于Hanks氏液或Earle氏液中。Dulbecco MEM还须加Fe(NO3)3·9H2O0．1mg。②BME=基础培养液；MEM=最低要素培养液。③如用DL氨基酸，量须加倍。④Eagle氏液还有修正配方，在剂量上稍有变动。
自己配制Eagle氏培养液要花费很多时间，对于用量不多的单位是得不偿失的。国外有配好的培养液商品，买来就用，但价格昂贵。国内应用最多的是MEM粉剂，在4℃保存有效期为一年。这种商品粉剂的规格很多，常用的有2种：一种未加谷氨酰胺，这种粉剂10g加双蒸水1000ml溶解后可经121℃高压蒸气灭菌，用前加3%谷氨酰胺10ml。另一种已加谷氨酰胺，它不耐高温，必须经过滤灭菌。为此购买时仔细阅读瓶上说明书。配好的培养液在4℃保存最好不要超过2周。
四、Parker氏199培养液
这种综合培养液比Eagle氏液复杂得多，对细胞的生长需要考虑更全面，因此效果更好，可以不加血清即可作为维持液。由于所含成分很多，自己配制更麻烦，因此本书不具体列出，读者有兴趣可参考有关书籍。一般都用商品粉剂，自己稀释配制。这种培养液不能耐高温，通常用0．22～0．35μm滤膜过滤灭菌。
五、RPMI—1640培养液
这种综合培养液与199培养液比较接近，但更适宜于培养白细胞。也有商品粉剂出售，由于要求营养全面，成分复杂，所以价格昂贵。配制方法与199同，如果不含NaHCO3和谷氨酰胺(过滤灭菌后临时加入)，则可用121℃高压蒸气灭菌。
六、血清
虽然综合培养基的配方尽量满足细胞的生长要求，但绝大多数细胞的生长仍需某些天然物质，主要为血清。各种动物的血清都可试用，但大多数细胞用牛血清生长最佳。胎牛血清比犊牛血清效果更好，但前者国内没有生产，且价格昂贵，所以都用未吃初乳的犊牛血清。我国不少厂商有犊牛血清出售，但不少单位喜欢自己制备，步骤如下。
1．准备10000ml的采血瓶，连接橡胶管和玻璃导管，包扎后高压蒸气灭菌。
2．将犊牛固定在手术台上，将颈静脉沟皮肤消毒，切开，钝性分离肌肉，找到颈动脉，拉出切开。
3．插入导管，使血液流入玻瓶，直到犊牛血尽死亡。
4．将橡胶管扎紧以防细菌侵入，玻瓶在室温中放置过夜，使血液凝固后析出血清。
5．分离和收集血清，如混有红细胞可经离心除去。严重溶血者不能使用。
6．取样1ml接种肉汤，如发现有细菌污染则须用5号垂熔玻璃滤器或0．35μm孔径的滤膜除菌。
7．无菌分装50～100ml玻瓶，密封后在58℃灭活30min。
8．有些血清对细胞有毒性，因此使用前先取少量配成生长液作试验。最好将几批对生长满意的血清混合后再用。
9．血清在-20℃可保存6个月以上。使用前要在4℃缓慢融化，不得反复冻融。
七、几种常用培养液的配方
(一)原代和二倍体细胞的生长液(促进细胞分裂的培养液)
1．0．5%乳蛋白水解物 85～95%
犊牛血清 5～15%
青霉素 50～100IU／ml
链霉素 50～100μg／ml
7%NaHCO3 适量(校正pH=7．2)
2．0．5%乳蛋白水解物 40～50%
Eagle氏MEM 45～45%
犊牛血清 5～15%
青霉素 50～100u／ml
链霉素 50～100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH7．2)
3．Eagle氏MEM 85～95%
犊牛血清 5～15%
青霉素 50～100IU／ml
链霉素 50～100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH7．2)
4．RPMI—1640 80%
犊牛血清 20%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH7．2)
以上几个配方根据细胞种类和生长难易灵活选用和增减血清含量，例如鸡胚细胞可选用第1个配方，血清可用5%；白细胞应选用第4个配方。
(二)原代和二倍体细胞的维持液 ——这类培养液不要求促进细胞分裂，而是尽量长久地维持培养细胞的良好状态，同时犊牛血清含量要减少甚至不加，这样有利于接种病毒的生长。
1．Eagle氏MEM 99～99．5%
犊牛血清 0．5～1．0%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
NaHCO3 适量(校正pH=7．6)
2．199培养液 100%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
NaHCO3 适量(pH7．6)
(三)传代细胞系的生长液
1．Eagle氏MEM 90～95%
犊牛血清 5～10%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH=7．2)
2．199培养液 95%
犊牛血清 5%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH=7．2)
(四)传代细胞系的维持液
1．199培养液 98～99%
犊牛血清 1～2%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH=7．6)
2．Eagle氏培养液 99～99．5%
犊牛血清 0．5～1．0%
青霉素 100IU／ml
链霉素 100μg／ml
7%NaHCO3 适量(pH=7．6)
根据细胞系的要求选用合适的培养液，并可作适当修改。