酶水解法

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《土壤农化分析手册》第596页（1748字）

(一)适用范围 适于样品中含半纤维素及一些五碳聚糖高的样品，如草本植物(牧草等)的茎、叶中有较多的半纤维素；种子的淀粉含量虽高，但也有些五碳聚糖可被酸水解。若须取得精确结果，最好采用酶水解法。

淀粉酶有严格的选择性，它只水解淀粉而不水解其它成分。酶将淀粉先水解为麦芽糖及糊精，最后也都水解成葡萄糖。测定所得葡萄糖量，就可计算淀粉含量。

(二)试剂配制

(1)20%NaOH。

(2)甲苯。

(3)淀粉酶。

(4)20－25%HCl：浓HCl696ml加水至1L。

(5)磷酸盐缓冲溶液：11．876gNa₂HPO₄·2H₂O溶于1L水中。另称取9．079gKH₂PO₄溶于另1L水中。然后取Na₂HPO₄溶液300ml与KH₂PO₄700ml混合即可。

(三)测定步骤称取风干磨细并通过60目筛的样品1．000－2．000g于250ml三角瓶中，加少量冷水使样品湿润，迅速加入约100ml热水，并置于沸水浴中加热1h，使淀粉完全胶化。胶化时淀粉粒的外膜破裂，水能透入淀粉粒的内部，这时淀糖溶解，淀胶膨胀，形成浆状溶液。

1h后取出三角瓶，冷却至约50－55℃加入0．03－0．05g淀粉酶。此淀粉酶须事先加3－5ml水用玻棒研磨，然后再加入，使它容易与溶液混合；否则淀粉酶干粉可能粘于三角瓶的内壁，或在液面上形成小块，从而减弱了淀粉酶的作用。加入淀粉酶后，立即加入磷酸盐缓冲溶液10ml，甲苯5滴，用软木塞塞紧，然后将三角瓶放置于45－55℃恒温箱中保温2昼夜或更长。

保温2昼夜后，取出少量试液(最好取瓶底上的沉淀)，放在载玻片上，加2滴I₂-KI溶液，用显微镜检查是否还有淀粉粒。若是淀粉尚未完全糖化，应将溶液重新煮沸，冷却至50－55℃，再加入甲苯及淀粉酶，加塞后在恒温箱中继续水解。

糖化结束后，将溶液冷却，洗入250ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后过滤。

取滤液100ml于250ml三角瓶中，加入20%HCl10ml，放入沸水浴中3h，塞以带有空气冷凝管的塞子，使淀粉水解生成的糊精和麦芽糖再经酸水解为葡萄糖。

3小时后将内容物放冷，用20%NaOH(约需10ml)中和至红色石蕊试纸变为蓝色为止(若工作需延至次日测糖，则溶液暂勿中和，以防止微生物作用)。

将已中和的糖液洗入250ml的容量瓶中，用水定容，过滤得清液，即可测定其中还原糖量。

吸取以上清液10ml(含还原糖2－20mg)，用斐林碘量法测定其中的还原糖量。

也可选用别尔特朗等法测还原糖量。

(四)结果计算

(五)注释

①加入淀粉酶时，若三角瓶内溶液温度高于55℃，若到70－75℃，酶活性将大大降低，或将完全失去作用。此后保温温度必须严格控制于45－55℃。

②酶水解保温时间因样品种类异。有的样品如马铃薯淀粉的酶水解可延至5昼夜。

③糖化后的滤液100ml加入20%HCl 10ml，为使溶液最后达2%的HCl酸度，也可用其它浓度如25%HCl调节。