植物种及品种的染色体计数鉴定

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第55页（4940字）

植物种及品种染色体计数鉴定的方法很多，这里仅将其中几种有效的方法简介如下：

1．醋酸洋红染色法 以小麦为例说明根尖分生组织细胞染色体的制片观察过程。

(1)取材 将小麦种子置于纸床发芽。当根尖长出1－2cm时，切下1cm左右的根尖，进行前处理。取材时间一般应在上午10－11时，因为在这段时间，根尖分生组织细胞分裂活动最旺盛。

(2)前处理 将切下的根尖浸入0．04%－0．2%的秋水仙碱溶液中处理2－5小时，然后用水冲数次。若不用秋水仙碱，可将材料放入蒸馏水中，在0－3℃(最高不超过5℃)条件下处理24小时。

(3)固定 一般用醋酸酒精固定3－24小时，(如急需观察，固定时间可缩短至10分钟左右，甚至可省去这一步，直接放入醋酸洋红染色压片)。固定后的材料用95%酒精洗净其醋酸味，移入70%酒精中，放在阴凉处保存。

(4)解离 用刀片切取1－2cm根尖，放在载玻片上，加一滴盐酸酒精液处理约10分钟，然后用水冲洗。在水洗前最好用50%酒精洗一遍。

解离的另一种方法是将固定后的根尖用流水冲洗10分钟左右。然后放入1N盐酸中，于60℃水解10分钟，取出，水洗1－2次，再放入2%果胶酶水溶液中，在室温下处理30－60分钟，取出，水洗1－2次。这种水解方法效果更好，使细胞更易分解，染色体也较易展开。

(5)染色和压片 在解离后的材料上加一滴醋酸洋红染液，放置约10分钟，待根尖染至暗红色，加盖玻片。并以吸水纸或纱布放在盖玻片上面，左手指按住载玻片，用右手指在吸水纸或纱布上对准根尖部位施加压力(也可用铅笔的橡皮头轻轻敲压)，将根尖压成一均匀薄层。应注意，施用压力要适当，以便使细胞和其中的染色体散开而不致被破坏。在压片过程中，注意不要移动盖玻片。为了增强染色效果，可将载玻片放在酒精灯上微微加热。

(6)观察计数 为了计数染色体，一般每片放5个根尖，分放在盖玻片能盖住的范围内。经染色和压片后，放在显微镜下观察。为了观察和计数应找到分裂中期的细胞。

水稻、玉米、高粱、黑麦、棉花、蚕豆、洋葱、辣椒等作物根尖分生组织细胞染色体的制片方法，基本上与小麦相同。但应注意以下几点。①因各种作物根尖分生组织细胞分裂活动最旺盛时间并不相同，故每种作物最适宜的取材时间也有所不同。例如，辣椒一般在下午1时，水稻在下午4时，洋葱在半夜至1时等。因此在开始作某种作物制片时，如不知其细胞分裂活动的规律，可在一昼夜24小时内，每隔2小时取样观察一次，以确定最适的取材时间。②水稻等作物，因染色体的去氧核糖核酸含量较少，故不易着色。这就需可把染色时间延长至1－10小时。压片后还嫌色浅，可从盖玻片边缘反复加几次染色，在火焰上来回烧几次，染色体的着色效果就可好些。

2．龙胆紫染色法 如用龙胆紫药水代替醋酸洋红染液，就更为经济简便。其步骤基本上与醋酸洋红染色法相同。只是在解离后加1%龙胆紫药水一滴，染色约10分钟，然后取出根尖，放在载玻片上，加20%醋酸液一滴，进行压片。

该法须注意两点：①紫药水易使材料变硬，不易压散，故可适当延长解离时间。如小麦根尖可用盐酸酒精液解离20分钟左右。②紫药水易使材料着色，也易褪色。因此，制作永久片，则不适用紫药水染色。

3．铁明矾苏木精染色法 为了拍摄较清晰的染色体图样，并想较长时间地保存制片标本，最好用本法制片。其具体步骤如下：

(1)取材及前处理 取根尖约6mm放入蒸馏水中，在1－3℃条件下处理24小时，或在0．2%秋水仙碱溶液中处理2－5小时。

(2)固定 把材料移入醋酸酒精固定液中固定3－24小时。

(3)解离 将固定的根尖水洗10分钟左右，移入1N HCl中于60℃下处理10分钟，或在5N HCl中于室温下处理1小时，然后水洗1－2次。若接着用2%果胶酶溶液，在室温下处理30－60分钟，则效果更好。

(4)染色 将根尖浸入4%铁明矾水溶液中媒染20－30分钟，其后水洗约10分钟，再放入0．5%苏木精溶液中染色1小时，或更长的时间，然后水洗。

(5)压片 先加1滴45%醋酸于材料上进行压片，也可先在45%醋酸中软化分色8分钟后再压片，然后进行镜检。

染色后的材料，如不能及时压片，可将根尖放入蒸馏水中，在1－3℃冷藏。因为冷藏可以改变细胞质的胶体状态，使细胞不易破裂，从而使染色体在压片过程中不易丢失。冷藏后若需压片时，仍在45%醋酸中压片。

4．孚尔根氏染色法

细胞内的去氧核糖核酸，通过水解作用而释放出醛基，再用锡夫氏液(即无色亚硫酸复红溶液)进行染色，上述醛基即与亚硫酸复红结合，呈现紫红色的颜色反应。这个反应是去氧核糖核酸所特有的。现已知道细胞中去氧核糖核酸主要存在于染色体上。如用此法处理细胞时，染色体明显呈现出紫红色。所以该法能清楚地显现出染色体的结构。

该法的主要步骤摘要如下：

(1)染色前的步骤与苏木精染色法相同。

(2)染色 将解离后的根尖材料水洗1－2次，放入锡夫氏液(无色亚硫酸复红液)1小时以上，然后在亚硫酸水中洗3－5次，每次10分钟以上，再用蒸馏水洗几次后即可压片。为了增加染色效果，可进行重染。即将经过上述处理的根尖放在载玻片上，加上1滴醋酸洋红重染，再进行压片。

5．铁丙酰洋红染色法(改良孚尔根氏染色法)

根据美国E．Margaret等人(1967)研究，这种方法可有效地鉴定黑麦草、小麦和大麦等植物细胞的染色体。其黑麦草的具体步骤如下：

(1)培养幼苗 将黑麦草种子用纸床培养，先放在5℃黑暗下处理3天，然后移至20℃发芽箱培养，直至幼苗根长到大约5－15毫米长度。

(2)前处理和固定 在上午10时或下午2时半细胞处于分裂中期时，将发芽的整粒种子或取下幼根浸入1%六六六溶液里冷冻24小时，然后用自来水淋洗，再放入卡诺依(Canoy)溶液(6份95%酒精，3份氯仿和1份冰醋酸配成)里，至少固定24小时。

(3)解离和前染色 从卡诺依溶液中取出根尖，淋洗后，再放入1N HCl溶液中，在59－60℃下水解8－10分钟，然后再淋洗，再放入孚尔根氏(Feulgen)(无水亚硫酸复红溶液)溶液中至少30分钟。

(4)染色和压片 将经解离和前染色的根尖部分放在载玻片上的铁丙酰洋红溶液(Iron-Propionacarmine)里染色，用解剖针将根尖弄成碎片，再加入1滴威尼斯松节油，并盖上盖玻片，加压。利用威尼斯松节油是为了在压片时，增加粘度，使染色体较好的离散开，并可制成永久性玻片。

(5)观察计数 一般情况下，对大多数植物染色体的观察计数，以利用40倍干物镜为宜。在个别情况下，需用100倍油镜进行观察计数。这里引黑麦草的二倍和四倍的染色体涂片图(图6－4和6－5)，供参考。

图6－4 二倍体黑麦草细胞分裂中期的染色体数目(14个染色体)

(E．Margaret，1967)

图6－5 四倍体黑麦草细胞分裂中期的染色体数目(28个染色体)

(E．Margaret，1967)

【参考文献】：

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