单细胞藻类的培养方法

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《水产养殖手册》第671页（8226字）

一、培养基的选择和配制

培养基需根据拟定培养对象的生长环境和需要精心选择和配制，主要应考虑：

1．pH范围及缓冲能力。

2．主要离子的组成和浓度，如K⁺、Na⁺、Ca、Mg、、SO₄^-、C1^-等。

3．使用氮源 多用尿素、硝酸盐或铵盐作为氮源。使用时根据种的特性和对pH的影响而定。一般藻类含约7—9%的氮，如果要达到0．5g／L干藻的生物量，那么．至少需要尿素80—100mg／L或KNO₃200—300mg／L。

4．碳源 通常提供含1—5%CO₂的空气，或以浮动气包供CO₂作为碳源。气包半筒状，下方使水、气直接接触，CO₂不断扩散入水；碳酸氢钠(0．1—1．0g／L)亦是有效碳源。

5．微量元素如Mn、B、Cu、Zn等一般使用微克(μg)级。

6．可能需要添加的有机因子或生长因子，如维生素类等。

供用培养基以表观清彻透明、无混浊或沉淀产生为准。作为保种或再扩大种源用时，培养基需经过灭菌(15磅⁽¹⁾，20min)。其中的P(K₂HPO₄或KH₂PO₄)、Si(Na₂SiO₃)以及有机或生长因子，需分别灭菌(或过滤)后再另行加入，以免产生沉淀或遭破坏。以海水作水源进行单细胞藻大量培养时，需考虑天然海水中主要离子的浓度，一般只需加N、P、Fe、Si即可，上述5和6两项可以省略。

二、常用培养基配方示例

1．HB₄培养基

(NH₄)₂SO₄ 0．20g

Ca(H₂PO₄)₂ 0．03g

MgSO₄·7H₂O 0．08g

NaHCO₃ 0．10g

KCl 0．025g

FeCl₃(1%) 0．15ml

土壤浸出液 0．5ml(或A₅ 1．0ml)

水 1000ml

其中，微量元素贮备液A₅为在1000ml水中溶有的微量元素量(g)为：H₃BO₃ 2．86，MnCl₂·4H₂O 1．81，ZnCl₂0．11，CuSO₄·5H₂O 0．08，Na₂MoO₄·2H₂O 0．39。在土壤浸出液的制备中，土壤的选择十分重要，一般应选择既无大量腐殖质，又无大量化肥，带有少量粘土和加入液体中以后较快下沉的土壤。

HB₄培养基可以成功地用于培养淡水产单细胞绿藻，如蛋白核小球藻和斜生栅藻等。

2．ASP₂培养基

Na₂EDTA 0．030g

FeCl₃·6H₂O 0．0039g

NaCl 5．0—18．0g

MgSO₄·7H₂O 5．0g

KCl 0．6g

CaCl₂·2H₂O 0．37g

NaNO₃ 1．0g

KH₂PO₄ 0．05g

Tris 1．0g

P₁金属液 10ml；pH7．9—8．1

H₂O 1000ml

其中，P₁金属液系在1L水中将H₃BO₃3．43g，CuSO₄5H₂O0．3，CoCl₂·6H₂O1．2，MnCl₂·4H₂O432．0，ZnSO₄·7H₂O66。5和Na₂MoO₄·2H₂O3．8mg，FeCl₃6H₂O制成贮备液，暗中保存备用。

该培养基多用于实验室培养和保种，系广谱性的，通过调节NaCl的含量，调节盐度，可用来培养海水、半海水乃至淡水生单细胞藻；它多用于蓝藻，同样可用于绿藻，也被介绍为硅藻’如三角褐指藻、菱形硅藻(Vonshak，1986)和细柱藻(W．Y．Lee et al，1985)等的良好培养基。若加入Na₂SiO₃·5H₂O(200—300mg／L)对硅藻培养效果更佳。

3．水生硅1培养基

NaNO₃ 120mg

MgSO₄ 70mg

K₂HPO₄ 40mg

KH₂PO₄ 80mg

CaCl₂ 20mg

NaCl 10mg

Na₂SiO₃ 100mg

FeC₆H₅O₇ 5mg

MnSO₄ 2mg

土壤浸出液 20ml

H₂O 1000ml；pH7．0

配制时柠檬酸铁不易溶解，先加水煮沸使溶后再配制，此培养基用于培养淡水产硅藻效果颇佳。

4．螺旋藻培养基(Zarrouk，1966)

NaCl 1．0g

MgSO₄·7H 2O 0．20g

CaCl₂ 0．04g

FeSO₄·7H₂O 0．01g

EDTA 0．08g

K₂HPO₄ 0．50g

NaNO₃ 2．50g

K₂SO₄ 1．00g

NaHCO₃ 16．80g

H₂O 1000ml

5．用海水配制简易培养基

NaNO₃ 60—200mg

KH₂PO₄ 10—50mg

FeC₆H₅O₇ 0．5—2．0mg 5．0—10mg

NaHCO₃ 100—1000mg

海水 1000ml；pH7—8

此简易培养基之组分范围可成功的培养海水硅藻的绝大多数种类，如三角褐指藻、菱形硅藻和小环藻(张宪孔等，1988)，牟氏角毛藻(马志珍，1987)以及金藻中的等鞭金藻(陈椒芬、潘永尧，1987)。删除NaSiO₃，亦同样可以培养扁藻、盐藻和海生小球藻。内陆地区为培育蟹、虾苗，以配制的咸水代用天然海水制备的培养基也有同样的养藻效果。

三、藻种来源和培养条件

培养用单细胞藻种可自行采集分离，也可方便地索取。国内可提供藻种的单位有：中国科学院水生生物研究所藻种保藏室，该室保藏有近700种，主要是单细胞蓝藻淡水种类及部分海生种类。青岛海洋大学微藻培养室，中国科学院海洋研究所和水产科学研究院黄海水产研究所均有藻种保藏。

除营养元素外，单细胞藻类的生长尚需适宜的光、温度和盐度等一些基本条件。

光能是光自养生物的唯一能量来源。真正为细胞接受并进行光合反应的只有可见光部分(400—700nm)。培养单细胞藻类一般采用阳光或人工光源(日光灯或钨灯)，光照时间和光的强度往往因种而异。光能有多种表示法，通常光照强度表示为勒克司(lx)，晴天正午地表直射阳光光强约为6万—10万lx。也有以能量表示的，由于涉及到波长，故各种表示方法之间的换算十分复杂。全日光的不同表示法大致有如下的关系：

1000lx=1000M Candle (米烛光)

(1 klx)=93Fd Candle (尺烛光)

5W／m² (瓦／平方米)

=5×104ergs／cm²·s(尔格／平方厘米·秒)

22μmolq／m²·s(微克分子量子／平方米·秒)

(μE／m²·8)(微爱因斯坦／平方米·秒)

一般而言，光强与培养物密度有关，当培养物细胞较稀时，使用较低的光强，随着细胞量的增加，光照强度相应加大。

温度对单细胞藻类生长的影响往往与光照成为综合因子。在多数情况下，喜高温的种类需要较高的光照强度，反之亦然。

下表列述了几种常用饵料藻类对光照、温度以及盐度等培养条件的需求。

表40—6 几种常见饵料藻类的部分培养条件*

* 表列有两行数字者，上行为最适范围，下行为可适应范围。

此外，众所周知的原因，大多数藻类培养需要搅拌。在上述全部种类的培养中，搅拌是必不可少的。一般可采用充气法或机械搅拌，其强度以保持培养物均匀悬浮为宜。

四、培养程序

1．接种 自固体斜面藻种转入液体培养。以灼烧放冷接种针在无菌条件下取原种少许(肉眼可见)，置入备好的小三角烧瓶(50ml；内盛约20ml无菌培养基)内，棉塞封口后置弱光下(最适生长光强的1／2—1／4)，振荡培养至有颜色出现，移至正常光强下，继续培养至表观色浓(对数后期，约100—500万细胞／ml)。培养物经显微镜镜检，确定无污染和虫害后，以约1∶5—10(种液∶新鲜培养基)的比例依次扩大，新接培养物以表观可见培养藻颜色为宜。

2．扩种 将液体种扩入10L血清瓶(最好以消毒棉塞封口)，或50L左右的玻璃水族箱，以日光或两侧日光灯(4只×2)照明，保温通气培养，并逐步扩入几方水体的培养池。一般而言，随着种的扩大，特别在生产性培养上，接种量大具有明显的优越性，在种源允许时，可尽量采用。

3．大池培养 使用敞开式水泥池较为实用，池型设计注意加横隔并以叶轮搅拌，使培养物回流，水深以15—25cm为宜。培养中注意光照、温度和pH的调节，观察水色变化，镜检监视生长情况和可能发生的虫害。

五、敌害生物防治

一些原生动物如腹毛虫、变形虫、尖鼻虫等以及其他一些微型动物如轮虫、水蚤类等的繁殖漫延，往往成为单细胞藻类培养中的重要敌害。此时，可以利用虫、藻个体大小的差异将大部分敌害生物滤除，一般采用标准筛绢21和25号或国产尼龙筛网M×79—103(孔径小于70μm)。如能连续过滤数天，滤除效果更好。一些与单细胞藻类个体大小相近的鞭毛类敌害生物，如尖鼻虫、小白虫或称之为绿变藻等可以大量吞食培养藻类，特别是三角褐指藻和菱形硅藻等，可用20mg／L的漂白粉(有效氯20—25%)处理污染培养物，经5h后，绿变藻和变形虫等敌害生物死亡，培养藻生长虽受到一定影响，但经曝气后尚可变活。用水和器皿均经20—30mg／L的漂白粉消毒，以杀灭和防治敌害生物，是目前较为实用的方法。

藻细胞在旺盛生长时，亦可能产生排他性物质，从而对敌害生物的生长繁殖有某种抑制作用。因此，利用及时转接种的方法，也可以相对防止或减轻敌害生物的污染。

(编者：张宪孔 审者：陈明耀)