培养程序

出处:按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第59页(1869字)

用胡萝卜培养程序作为离体培养的体细胞胚胎发生的代表性例子。

1.在无菌条件下,将一片0.5—1cm叶柄外植体或是一块0.5cm3贮藏根外植体放在含有4.5μm2,4-D的琼脂培养基上。

2.光或暗培养4个星期,这样可以获得充分的愈伤组织生长。

3.将2—3克的愈伤组织置入盛有50m1含有4.5μM2,4-D液体培养基的250m1锥形烧瓶或培养瓶内进行继代培养,锥形瓶放在一个转动振荡器上,每分钟转动125—160次,培养温度为25℃,培养瓶置放在一个回转器上,每分钟旋转一次。这个培养阶段,光照的有无,无关紧要。

4.锥形瓶中的培养物继代培养约14—18天,培养瓶中的培养物继代培养约21—28。一种较为迅速的继代培养途径能够进行快速增殖。

5.在无菌条件下,将第四步培养阶段的陈旧培养基内的培养细胞转入不含2,4-D的培养基上,以诱导胚的发育。

6.为得到较为均匀的胚群体,将原胚悬浮液通过一系列不锈钢网筛,从最初的200μM开始一直到较精细的筛子。胡萝卜培养液在通过74μM筛子后产生一种相当致密的单一悬浮体以及细胞小团,通过43μM网筛筛过后,产生了一种非常好的悬浮体,它是一种单一化的细胞团,但密度低。

7.将清洗过筛过的悬浮体转入盛有50ml MS基本培养基的250ml锥形瓶内或转入盛有10ml培养基的培养管内。为了使胚的发育较为正常,可在转移时,添加0.1—1μM的ABA到培养基内,这样可以抑制早熟萌发和根的延伸。ABA能够在一种完全黑暗中,在环境温度的蒸馏水中缓慢地溶解。ABA应该在过滤灭菌后再加到高压消毒过的凉的培养基上。

8.为了使胚发育更为正常,培养物应当在完全黑暗条件下生长。正常情况下,胚大约在第八天显露,在第10—15天达到成熟程度。

9.体细胞胚可以转移到不含2,4-D的琼脂培养基上,以促使其再生植株。

10.再生植株移入Jiffy盒或泥炭土中,进行尔后的发育。

【参考文献】:

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