培养程序

出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第59页（1869字）

用胡萝卜培养程序作为离体培养的体细胞胚胎发生的代表性例子。

1．在无菌条件下，将一片0．5—1cm叶柄外植体或是一块0．5cm³贮藏根外植体放在含有4．5μm2，4-D的琼脂培养基上。

2．光或暗培养4个星期，这样可以获得充分的愈伤组织生长。

3．将2—3克的愈伤组织置入盛有50m1含有4．5μM2，4-D液体培养基的250m1锥形烧瓶或培养瓶内进行继代培养，锥形瓶放在一个转动振荡器上，每分钟转动125—160次，培养温度为25℃，培养瓶置放在一个回转器上，每分钟旋转一次。这个培养阶段，光照的有无，无关紧要。

4．锥形瓶中的培养物继代培养约14—18天，培养瓶中的培养物继代培养约21—28。一种较为迅速的继代培养途径能够进行快速增殖。

5．在无菌条件下，将第四步培养阶段的陈旧培养基内的培养细胞转入不含2，4-D的培养基上，以诱导胚的发育。

6．为得到较为均匀的胚群体，将原胚悬浮液通过一系列不锈钢网筛，从最初的200μM开始一直到较精细的筛子。胡萝卜培养液在通过74μM筛子后产生一种相当致密的单一悬浮体以及细胞小团，通过43μM网筛筛过后，产生了一种非常好的悬浮体，它是一种单一化的细胞团，但密度低。

7．将清洗过筛过的悬浮体转入盛有50ml MS基本培养基的250ml锥形瓶内或转入盛有10ml培养基的培养管内。为了使胚的发育较为正常，可在转移时，添加0．1—1μM的ABA到培养基内，这样可以抑制早熟萌发和根的延伸。ABA能够在一种完全黑暗中，在环境温度的蒸馏水中缓慢地溶解。ABA应该在过滤灭菌后再加到高压消毒过的凉的培养基上。

8．为了使胚发育更为正常，培养物应当在完全黑暗条件下生长。正常情况下，胚大约在第八天显露，在第10—15天达到成熟程度。

9．体细胞胚可以转移到不含2，4-D的琼脂培养基上，以促使其再生植株。

10．再生植株移入Jiffy盒或泥炭土中，进行尔后的发育。

【参考文献】：

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