培养阶段基本要点
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第104页（13183字）
(一)第一阶段：培养物的建立
在第一阶段外植体可能发育成单一的枝条，也可能发育成丛生枝条，甚至发育成有根的植株。属一、二两种情况，我们用微型嫁接。然而无病毒植株再生通常更乐意通过第三种情况——一步再生植株的分生组织培养。
1．生长调节剂 尽管在试管中所培养的植株能合成少量的细胞分裂素，根仍然是细胞分裂素合成的主要部位。分生组织、茎尖和芽外植体没有足够的内源细胞分裂素维持它的生长发育，所以，表4-l所列的第一阶段培养基有85%供给细胞分裂素，通常用三种细胞分裂素：KIN、BA和2iP，BA对分生组织、茎尖和芽的培养最有效，第二为KIN，2iP很少用，它们使用的频率影响到有效程度。在表4-l中，含有细胞分裂素的第一阶段培养基中有68%的用BA，23%的用KIN，9%的用2iP、ZEA和SD8339，后三种细胞分裂素使用的百分率低，片面地归之于价格高和使用价值有限。我们应该知道，尽管某种细胞分裂素对某些植物影响不大，但对另外一些植物往往效果显着，例如，杜鹃花科植物方面，2iP是作为被选用的细胞分裂素。表4-1所列的第一阶段培养基中有15%的不含细胞分裂素，这可能是外植体体中存在足够量的内源激素。此外，一些植物在这些情况下也能偶然再生根系，例如草莓属、菜豆属、悬钩子属和茄属。这些再生根在剩余的激素耗尽之后，能够作为一种新的细胞分裂素的来源。然而在第一阶段的15%，在不含细胞分裂素的培养基中，没有一个能促使腋芽增殖。
生长素是新枝生长所需要的另一种激素，因为幼嫩枝条顶端是生长素合成的活跃区域，在第一阶段培养基中并非总需要外源生长素，特别从一个生长着的植物体上切取一个较大的茎尖时，所以在表4-1中所列第一阶段培养基中有40%是无生长素的。在有些情况下，外源生长素并非必要，但是它对第一阶段外植体生长是有益的，离体的长约0．4mm或更短的芽端和分生组织不可能产生(或维持)足够的内源生长素满足枝条的生长，因为这些原因，通常加入外源生长素。在植物组织培养中，IAA、IBA、NAA和2，4-D是最常用的生长素，IAA是4种生长素中最弱的一种，在光照下它对于那些含有IAA氧化酶活性的组织来说无效，不过，当它发挥作用时，IAA是很有利于器官形成的。相反，2，4一D是4种激素中最有潜力的生长素，它促进愈伤组织的形成，并强烈颉颃器官组织的发育分化。所以NAA普遍列为大多数实验室作为分生组织、茎尖和芽尖培养的生长素。在表4-1中，包含有生长素的第一阶段培养基中NAA占51%、IBA占27%、IAA为22%、2，4一D仅6%，而浓度为0．45至10．0μM。
在表4-1所列的第一阶段培养基中GA仅占17%，显而易见大多数外植体能合成足够量的GA。当应用GA时，它只是开始对芽的伸长有效，在第一阶段GA的浓度为0．29μM或更低，和其它类型的组织培养实验基本相同，其浓度是相当的低。
2．培养条件 很少有人从事最佳物理培养条件的研究工作，如温度、光照等。最适培养条件随植物种类而异，植物起源地的气候带提示我们应该采用多高的温度最适合?在分生组织、茎尖、芽培养方面多数工作者选择恒温培养，范围在20—28℃之间，但绝大多数采用中间的温度范围24—26℃，当温度升高到28℃以上时，水蒸气凝结在植株和容器壁上，这样会限制生长。就昼夜温度而言，对某些植物采用变温培养较好，特别是那些适应于温带和沙漠地带气候生长的植物更为必要，Minocha(1980)、Roggemans和Claes(1979)各自用25：20的昼夜温度进行了北美白桦切段和食大大黄分生组织培养，Zir(1979)用24：20的昼夜温度进行了唐菖蒲芽的培养。然而，大多数从事昼夜变温培养的工作者进行随机选择时并无实验依据。也有一些报道提及晚间较低温度培养效果问题。
对于温度的选择、光照时间、光照强度，以及光质通常也是随机选择的。为了在试管里最大限度地增加生长量以及防止休眠，除极个别而外，都采用长时间光照(每天12—24h)，最普遍的光照时间，是光照16h对黑暗8h，光照强度常为1—10klx，因为光能够促使一些多酚含量高的外植体变成褐色，所以降低光照强度于1klx以下或者甚至保持它们在黑暗中。在多数情况下，利用荧光灯或Gro-lx型灯提供光源，有时增设小瓦特的白炽灯以便提供光谱区的红光和远红光。
空气湿度在诱导期并非经常给予控制。一般保持相对湿度在60—80%，最常用的为70%。
3．多酚氧化作用 许多植物富含多酚化合物。在切割时，这些组织损伤后其多酚化合物在多酚氧化酶的作用下发生氧化，组织逐渐变成褐色或黑色。这些氧化产物限制了酶的活性，杀死外植体，使组织和培养基变成黑色。这种现象对最初培养体的建立，尤其是对木本植物会带来一种严重的障碍，曾采用不同的方法予以解决：①在培养基中加抗氧化剂；②外植体接种在培养基之前预先浸泡于抗氧化剂中；③在起始培养的初期置于弱光或黑暗条件下培养；④一旦发现培养基变色，立即将外植体转移到新的培养基上。
4．抗氧化剂包括维生素C、PVP、DTT、牛血清蛋白 已报道在LS琼脂培养基中加入上述物质培养Anigoxathos的芽，对未成熟的美洲擦木胚也进行了同样的培养实验，但都没有效果，考其原因之一归究于采用了固体培养基，根据Ichihashi和Kako(1977)的研究，在静止状态下，液体培养基中加一种抗氧化剂，能够抑制Cattleya茎尖的变褐，多酚氧化酶活性抑制在固体培养基上，对抑制变色很少有效或无效，他们用的抑制剂为5mM的氰化钾、维生素C、半胱氨酸和硫脲，然而Sterenson和Harris(1980)报道在倒挂金钟茎尖培养中用PVP-10(0．01%)使琼脂脱色还原。
Gupta等人(1981)用Tactona granis的芽进行预备实验，结果是培养基变成黑色，所有的外植体死亡。为了减少变色，将外植体悬浮在含有各种抗变色剂的0．058M蔗糖溶液中，在移植到MS固体培养基之前，将其在旋转振荡器上振荡45min。实验所用的介质为5%的H2O2，0．28mM维生素C，0．7%可溶性PVP和0．7%的Polyclar AT，这些处理都能减少变黑。与苯酚以H链相连的Polyclar AT(不可溶的PVP)处理的外植体能长成复芽。最近Polyclar AT已经被不溶性的聚乙烯吡咯烷酮(=PVP)所代替，它也具有同样效果。在Anigozanthos芽的培养中，McComb和Hewton(1981)将材料进行表面消毒后，并切取外植体在0．55mM的抗坏血酸溶液中。但没有报道这种预处理是否减少了组织变褐及外植体损坏。
由于这些有害的酚氧化产物是在光照下形成的，所以在第一阶段培养初期减少光强是有益的，Wang和Huang(1974)的实验获得这样的结果：第一个月的光强为150lx时，大蒜分生组织半球形外植体变为褐色的少于4%；光强为500lx时，变为褐色的为18%。为了减少酚氧化物的积累，采用最初黑暗培养周期(1—6周)。然而这些黑暗培养的有效程度没有报道。
(二)第二阶段：繁殖体的增殖
这个阶段的主要目的是最大限度地产生出有用的繁殖体。我们可以用三种方法达到这一目的，在这一节中仅介绍“腋芽繁殖”，尽管在离体培养中这种方法的增殖速度比其它的两种方法要慢，但它遗传性稳定，而且容易在大多数植物中应用，所以在最近几年来，这种方法已经广泛采用，例如，Murashige(1974)用这种方法繁殖时仅4种植物，到1981年底，在表4-1中至少增加了90种植物。用这个方法，在一年里，估计许多植物无性繁殖系植株可成百万倍地增殖。
1．生长调节剂 在“腋芽增殖”上，细胞分裂素用来抑制新枝顶端优势，促进腋芽生长发育。在表4-1第二阶段培养基中除有一个例外，其余都加入了细胞分裂素。抑制顶端优势的外源细胞分裂素的有效浓度随培养体系而变，和其它类型人工培养相比，细胞分裂素的浓度显得非常高。大概表4-1所列第二阶段培养基的3／4供以4．5μM或更高的细胞分裂素、1／4为25．0μM或更高。系统性采用90—270μM细胞分裂素是偶尔的情况，总而言之，BA对促进腋芽增殖是最有效的，以下的顺序为KIN和2iP，细胞分裂素的效应顺序在某些植物上又十分不同，例如，在杜鹃花科杜鹃花属和山月桂树。表4-1中所列第二阶段培养基中使用BA、KIN、2iP和ZEA的百分率分别为7．6%、19．4%、3%、3%。
外源生长素不能促进腋芽增殖，但是它们的存在能改善外植体培养时的生长，现已发现马铃薯腋芽增殖的潜力在试管中通过7—10次再培养后下降，这种衰退现象完全能够被附加有0．54μM NAA的培养基所控制和消除，表4-1中第二阶段的培养基中有48%的加入了这种激素。在第二阶段培养基中的生长素的作用之一可能是解除高浓度的细胞分裂素对腋生枝生长的抑制以及恢复正常新枝的生长，太高的生长素浓度不但抑制腋芽增殖，而且减少愈伤组织形成，特别是使用2，4-D时更是这样。表4-1中第二阶段附加有生长素的培养基所用的NAA、IBA、IAA和2，4-D分别为58%、26%、16%和0%。除一些例外情况，这种百分率应该反映了这些生长素在第二阶段培养基中的效应顺序。
表4-1中所列第二阶段培养基中20%的附加了GA，使用的浓度范围与其它试管培养系统相比显得很低，它对腋芽的伸长是极为重要的，Wochok和Sluis(1980)观察到用GA对滨藜枝条外植体进行全面处理，不但能促使枝条生长，而且促进增殖，其效果超过最有效的细胞分裂素和生长素结合使用。然而，Lundergan和Janick(1980)发现加0．29μM GA对苹果腋芽增殖和生长都无效果，Ancora等(1981)用朝鲜蓟作实验，他们提出GA在试管中对维持新枝再生不是必要的。
2．增殖率 由于增殖是成功的，具有商业性组织培养繁殖的主要经济指标，因此第二阶段增殖率就决定了这种植物在试管中再生的可行性。这个比率受许多因素的影响。但培养基的化学成分和植物材料的生理状况及发育阶段是最重要的。化学成分取决于上一部分我们已讨论过的外源生长调节剂的种类及浓度。在讨论植物材料的生理状况及发育阶段对培养反应的影响方面仅做了一点点工作，但决不可忽视这方面对枝条增殖的重要性。例如，在Garrizo citrange培养中，苗尖和节外植体生理状态上的差异，导致显着不同的增殖速率，它们的每个外植体分别为3．0和1．7株苗。
植物材料的生理状况及发育阶段通过培养过程可以改变。Gupta等(1981)在微型繁殖一颗20年生的柠檬桉树时发现，当外植体保持在23—25℃温度下它们就逐渐死亡，然而当把外植体预培养在15℃条件下3天，再转移至25℃的条件下，导致试管中的外植体生长并增殖成功。
大量的例子表明，许多植物种类通过连续继代培养，它们的颉颃阶段能够被逐渐地更改。McCown和Amos(1979)通过白桦的芽培养观察到，只要新的生长部分在以一个月培养为基础进行继代培养，其生长会变得很快，促进新枝再生逐渐变得越来越容易。Litz和Conover(1978)进行实验表明，新枝增殖率随着继代培养的次数增加而提高，在9次继代培养后增殖率达到7倍。
很明显保持植物材料在一个液体振荡系统中有一个短的周期，某些植物的生理发育阶段也能导致改变，同时能加速枝条再生。在试管中培养Malling Merton苹果根茎的芽，切割所产生的新枝，放置在液体培养基里，并在摇床上振荡培养4天，能够观察到一个较快的生长率，当这些新枝再次移植到固体培养基时，强烈的再生能力十分明显，在液体培养中振荡培养显得十分有益。Walkey和Cooper(1976)曾报道，当繁缕的顶端分生组织培养在一个静止液体培养基中不能诱导增殖和枝条再生；当放置在一个动态的液体培养基中，生长速度提商，腋芽增殖出有根的丛生苗。为了诱导成年桉树外植体的芽增殖，Gupta等(1981)发现对外植体除了进行15℃预培养外，保持已伸长的外植体在一个振荡的液体培养基2周是非常必要的，在以后的继代培养中既不需15℃的预培养也不需液体培养基。通过这种培养方法，他们在一年时间内，利用一个单生芽培养出10万多株植物。通过在琼脂培养基多次继代，表明这种液体振荡培养系统改善了植物生长状况，获得了新的所需要的生理发育阶段，但是这种系统并非对所有的植物种类都是必要的。很少有实验揭示培养环境对新枝增殖的影响，通常第一阶段和第二阶段的条件保持一致，Kitto和Young(1981)在每个Carrizo citrange茎尖的实验中将光强和新枝增殖的数目联系起来，报道了在0．0，2．2和5．7klx光强下，每个外梢体的新枝增殖数分别为1．3、3．0和2．1，这个报道说明这个方面的研究不可忽视。
(三)第三阶段：根的再生
这个阶段的目的是在第二阶段，以及某种情况下，第一阶段的新枝上再生不定根。第三阶段培养通常用试管培养10mm或更长的新枝。有时，在第二阶段枝条的伸长受到高的细胞分裂素的限制，所以很有必要选用一个恰当的新枝伸长期。在美洲擦木新枝转移到生根培养基之前，Wang将BA的浓度从264μM降到22．0μM，以促使新枝生长。许多草本植物的不定根容易诱导出来，而许多木本植物特别是成年树就困难了。第三阶段对于禾本植物来说可能是最难的。在这阶段，将对以上所报道的有益启示和技术进行检验。
第三阶段并非总是在试管中进行，McCown和Amos(1979)报道，当白桦的新枝放置在一个1∶1(泥炭土∶珍珠岩)、温度为30—35℃、湿度大于80%的培养温室里，发根率为100%，Kuse等人(1980)在一个产生周期性薄雾的温室里，把锥花石头花植株枝条短期移植在7个盛泥炭土的缸钵内，获得了60%的发根率。商品发根粉剂代替了生长素药剂，例如在新枝移植到长根培养基之前，可以用Rootone F预先浸泡枝条基部。Pyott和Converse(1981)发现在离体培养中，无法预言的红悬钩子无性系的发根率，而在一个产生周期性薄雾的温室里，将新枝培植在消毒的砂子内，获得了理想的发根率。
1．培养基
(1)生长调节剂 根的产生包括三个阶段：(a)诱导；(b)生根；(c)伸长。因为在大多数实验中很难将诱导阶段单独划分出来，所以一般将诱导阶段结合到生根阶段。从Skoog和Miller的经典工作，大家知道根的再生依赖一个低浓度的细胞分裂素和高浓度的生长素的比值，而第二阶段培养基所需要的激素与这样特殊的平衡恰好相反，所以第三阶段几乎不使用第二阶段的培养基。
在中国甘蓝芽培养方面Kuo和Tsay(1977)证明了外源细胞分裂素／生长素＞1适合于枝条的生长并且很必要，当比值<1时有利于根的产生。通常取自于第二阶段培养的枝条已含有足够剩余的细胞分裂素，所以第三阶段培养基中很少或者根本不需要细胞分裂素。表4-1揭示了只有27%的第三阶段培养基中加细胞分裂素，大多数培养基已经降低了细胞分裂素的水平到4．5μM或者更低。在试管中太高的细胞分裂素含量对单子叶和双子叶两种植物根的产生和生长是有害的。有时来自于第二阶段培养的外源细胞分裂素是足以抑制根的形成，将这些未发根的新枝，从原来的生根培养基移植到新鲜的成份含量相同的发根培养基中，可以导致根的形成。
因为生长素对根的分化是必需的，所以表4-1中所列的第三阶段，有86%的培养基中加这种激素。此外，大量研究指出，在普通的生长素中，对根的再生作用，以NAA最有效。表4-1第三阶段培养基中所用NAA，IBA，2，4-D和其它生长素的百分率分别为53，29，11，3．6和3．6。Nemeth(1981)利用苹果根茎作材料，试验了几种稀有的合成生长素对根的诱导能力，结果发现用5μM CDPPN进行处理，其发根率高于90%，效果比普通生长素诱导苹果枝条生根最有效的IBA更好。
因为正在生长发育的幼嫩新梢是生长素产生的富源地，所以在许多植物中第三阶段培养基中加外源生长素并非必要，当生长素的浓度太高时，在枝条基部将会形成愈伤组织，以致抑制根的正常发育，另外不期望高浓度生长素的理由是，根分化阶段后的根伸长阶段对生长素浓度相当敏感，高浓度的生长素将会抑制根的伸长。为了给较难生根的苹果根株茎有力的诱导根刺激，同时又要避免愈伤组织形成和根生长的抑制，在第三阶段培养中采用二步法，首先将枝条培养在含有生长素的“根分化培养基”中4—8天，然后将其转移到无生长素的“根发育培养基”中，这个步骤有效地防止了愈伤组织的形成，同时95%的生长，每个生根的植物体的根数为连续培养在含生长素的培养基中的3倍。为了促进根的诱导，Kusey等人(1980)将试管中所获得的霞草属枝条的基部在0．13mM NAA或0．12mM IBA溶液中预先浸泡5s，然后将其转移到不含激素的White培养基中进行根的分化发育。柠檬桉枝条移植到White培养基之前在11．0μM NAA溶液中浸48小时，成功地诱导出根。
表4-1中，第三阶段5%的培养基附加GA。据Pennazio所说，GA大大提高了马铃薯分生组织培养的发根率。另一方面，在离体培养实验中，Mosella Chancel等(1981)观察到GA对桃树枝条发根的诱导阶段将有抑制作用。
(2)生长素增效剂 尽管酚类化合物的作用机理仍然模糊不清，但为大家所熟知的它在生根阶段具有成为生长素的增效剂的能力。水果木本植物在离体培养中诱导生根的困难引了起Jones对树脂的探讨，它用间苯三酚(PG)获得满意的效果。其后用苹果根株茎、草莓、欧亚野李、桃等材料进行人工培养实验，都证明树脂具有诱导生根能力。除桃例外，其它所有的植物种类都受PG的抑制，人工培养中酚类化合物芸香苷和懈皮酮能够大大提高桃的发根率。
根据Mosella Chancel等人的研究(1981)，酚类化合物在生根“分化阶段”具有特殊作用。Jomes和Thurbon(1981)报道了在增殖期使用PG有利于促进根的形成，第三阶段的新枝的生根率和根系都相应增加。
实验表明，一种酚类化合物只有和其它生长素共同使用才具有增效作用。James(1979)已经探测到PG和不含吲哚的生长素NAA之间无增效作用。Mosella Chancel等人(1980)发现，芸香苷、懈皮酮最好分别与IAA、NAA结合使用。
(3)盐的浓度 B5、LS、MS和NN(见表4-1)等培养基都是富含N、P、K盐的培养基。有时在这高盐浓度下，尽管具备了各种激素也未能生根。当培养基的盐浓度降低到1／2、1／3或1／4的水平时，生根现象十分可观：Gupta等人(1981)用柠檬桉作材料，Kusey等人(1980)用锥花石头作材料，将在第二阶段MS高盐水平的培养基上离体培养所获得的枝条转移到低盐水平的WH培养基上，得到了理想的生根结果。
表4-1 分生组织、茎尖或芽离体培养以及腋芽快速增殖的植物种类
a．A=Anderson，1975；B5=Gamborg等，1968；BS=广泛培养基，Defossard，1974a；D=Dudits等，1975； GD=Gresshof和Doy，1972；GEW=Gamborg和Eveleigh，1978；HB=Harthey和Borker，1980；IS=Linsmajer和Skoog，1965；M=Miller，1963；MS=Murashing和Skoog，1962；MSB=MS盐+B5维生素；MSN=MS盐+NN维生素；MSW=MS盐+W维生素；MT=Murashige和Tucker，1969；NN=Nitsch和Nitsch，1969；QL=见Nemeth，1981引用；W=Walkey，1972；WH=White，1963；WPM=森林植物培养基(Lloya和McCown，1980)．
b．除指明的以外，培养基组成成份的浓度单位是mg／l。
c．AC=活性炭；NB=营养流体培养基；PG=间苯三酚。
尽管在一个培养基中较低的盐浓度有利于生根，但有时导致一个不良的顶端生长。Wang(1978)观察到1／9MS浓度的培养基促使100%的日本柳杉生根，但枝条生长不良，而另一方面1／3MS浓度的培养基能够使87%的发根，顶端生长良好。尽管Gupta等人(1981)将柠檬桉枝条从MS培养基移植到WH培养基上使枝条生了根，但是生根的枝条未能在这种低盐浓度的培养基上存活，叶子变黄脱落；如果在两周内即第一批根出现后将植物体移回到MS液体培养基中，黄叶转绿并形成一个良好的根系。
从表4一1可以看出，当第三阶段培养基的盐浓度降低时，表4-1所列的植物能成功地生根。
(4)支撑材料 在第三阶段大约9／10的培养基用琼脂作支撑物，它能够使培养基变硬，从而支撑根的生长。在生理学上，琼脂不是一种完全惰性材料，它是由多种可能对生长有影响的物质所组成的，这样在某些敏感的植物中，琼脂也许导致根生长不良。Lane(1979b)报道，当用0．6%的琼脂时，绣线菊和李的生根受到抑制。Kitto和Young(1981)探讨了Carrize citrange培养中琼脂浓度和生根能力成负相关，除了可能出现生长抑制物质外，另一个原因可能是培养基透气不良，生长组织所释放的有毒物质未能迅速扩散。通常采用下述两种方法防止琼脂培养基的抑制效应：(a)在琼脂培养基中加优质的活性炭(AC粉)，(b)液体培养基和滤纸桥系统。
活性炭在培养中能吸附有毒物质，借此促使根再生和发育，活性炭也能吸附来自第二阶段培养基的外源细胞分裂素。Takayama和Misawa(1980)报道BA抑制百合根的形成和生长，加入活性炭能够完全消除这个抑制效应，无BA的含活性炭培养基优于不含活性炭的培养基。活性炭在离体培养中对根系具有遮光作用，而强光能抑制根的生长。
液体培养基在表4-1所列的第三阶段培养基中大致占12%，它有利于有毒物质的自由扩散，当液体培养基与滤纸桥系统一并使用时，对根的生长发育提供了良好的通气条件，它的缺点是很多实验室需要准备这种“桥”很费事，除非经实验证明琼脂加活性炭培养基的效果不满意外，一般不推荐使用这种培养法。
在第三阶段培养基中利用聚氨酯泡沫塑料(橡胶)和蛭石代替高价的琼脂已经获得了满意的效果。用蛭石作衬底来支持和透气的液体培养基，在西瓜培养中获得了比培养在0．4—1．2%琼脂培养基中的根系有更好的分枝和较大范围的根毛区。此外，就对根系的损伤而言，从蛭石中移出的植物体比从琼脂移出的植物体的根损伤要轻。
2．幼龄 对于那些难以生根的植物，特别是森林树种，植物的年龄在根的再生能力上起着有效的作用。de Fossard等(1974)观察到当外植体取自于幼苗的基部培养时，巨桉根的发育最常见，从子叶着生处到顶端的36个芽发根率分别为21、21、11、6和0。Wang和Hu利用5年树龄的美洲擦木树芽培养，所获得枝条进行实验，结果发现部分生根，而来自同种植物胚外植体所获的新枝的发根率为100%。在柠檬桉微型繁殖中Gupta等人(1981)报道了与幼苗的芽外植体生根需要5．0μM生长素相比，20年树龄的芽外植体生根需要10．0μM生长素。
已知继代培养过程能够改变外植体生理状态和逐渐重现外植体幼年阶段特性。来自成年葡萄无性系的离体芽经2—3次继代培养诱导出幼年阶段的某些特征特性。Gupta等(1981)以一百年树龄的柚木为材料进行芽培养，生根率为10%，第二次及连续的继代培养后，其生根率提高到60%；而种苗外植体的生根率，总是在80%以上。20年树龄的柠檬桉的芽培养。Gupta等人(1981)报道，开始和第1一3次继代培养的外植体在第三阶段处理中没有一个能生根，然而在第四次继代培养后的外植体有35—40%的枝条生了根，第五次和连续的继代培养它的生根率大约为45—50%。这些报道清楚地表明，连续的继代培养可以更新成熟植物组织的生理发育阶段，使幼年阶段的某些特性得以重现。所以随着继代培养的继续进行，根的诱导逐渐变得越来越容易。
3．培养条件在上述几个阶段里，很少有实验揭示培养条件对生根的影响。一般而言，强光照有助于生长良好的植株形成，提高光强很大程度促进生长，而且所产生的植株能够成功地转移到盆钵中。由于强光照对根的生长有抑制作用，所以要特别小心强光照不能直接照射在根上。用铝箔将培养容器遮蔽起来，或者在培养基中加0．3%的活性炭能促进根的生长。这个时期的光照强度一般采用0．54到10klx的范围。
在开始的几个阶段大多数研究者采用恒温培养。Schnabdrauch和Sink(1979)报道在最初的再生苗转移到22℃，进行根的伸长之前，将它置于30℃环境条件下一周，能够加速天兰绣球变种茎尖再生苗的生根。
(四)试管苗移栽
试管中再生的繁殖苗生根后，将从无菌的容器中移植到盆钵里，移栽过程中应该考虑感染和失水等因素。无菌的混合土壤能避免严重的感染问题，为了达到微型增殖的目的，失水是最大的障碍，所以应予解决。据记载，移植后的植株叶子立即过度地失水，这样一个高水平的失水与下列因素有关：(a)上表皮蜡质少，(b)叶肉细胞间隙大，(c)气孔对水的拉力反应迟钝。由于这些复杂的问题，再生植株的木质部组织在根形成之前，在枝条基部的横切面形成一个致密的愈伤组织系统，从愈伤组织再生的根系与枝条的主要维管束系统很少有联系，因为这些植株是在高湿条件下培养的，这种结构在栽培上来说是毫无意义的，严重地阻止了水分向上运输。所以移植易导致植株尖端枯萎甚至死亡。
为了使再生繁殖苗适应外界环境，首先应该给一个相应的保湿时期，在这个时期里通过2—3周或更长的时间逐渐降低湿度，同时，小的试管苗经受形态和生理的适应，使它们发育成能经受自然界水分影响的植物体。
Lane(1979)将刚移栽的Bartlett pcar的小植株放在温室的雾床里，进行二周的锻炼处理，在温室的生长速度与种苗的生长速度一样，用这种方法在土中种植了500株。Barnes(1979)企图保持刚移栽的西瓜小苗，在一个周期性产生薄雾的高湿度条件下，结果成活率极低；进一步发现在温室里用干净塑料杯罩住能保持高的湿度，能够比较理想的移栽成功。一周后为让空气对流，可每天揭开杯子5—6h，当植株呈现生机勃勃且无萎蔫现象时，将杯子全部拿掉。Broome和Zimmerman(1978)将悬钩子的小植株栽植在倒置的玻璃缸内1—3周，其成活率为60%。值得注意的是在低湿度条件下直接暴露炼苗能够获得适应能力。Brainerd和Fuchigami(1981)将第三阶段培养瓶盖打开，长叶的苹果小苗培养在相对湿度为30—40%的室内，为了防止培养基干燥，每天加10ml蒸馏水，在盖子打开5—6天后，在15min内叶子上的气孔80%的关闭，与在温室内种植的比率一样。
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