抗除莠剂细胞突变体的选择
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第240页（12293字）
植物细胞和组织培养已经采用低浓度的除草剂选择其抗性。对一些苯氧类除草剂，三唑类，氨基甲酸类，联吡啶类除草剂和除草剂毒草定和甘氨酸衍生物已得到抗性细胞系和植株(表11-9)。尽管可比较容易得到抗性细胞系，经细胞培养程序得到抗性植株则较难。从烟草得到的突变体比任何其他种都多。
表11-9 从细胞培养得到的抗除草剂细胞系和植株
a．从抗除莠剂细胞培养物再生的植株。
b．在有些R植株中存在除莠剂抗性。
在细胞培养中有许多抗除草剂的例子，然而只有较少的例子从抗性细胞系再生植株。再生植株分成三种情况：(1)抗通常是致死剂量的除草剂，(2)耐除草剂(即在使用次致死剂量的除草剂时，植物存活数增加)，和(3)无抗性。从烟草的抗杂草强和甘氨酸衍生物的细胞系再生了抗除草剂的植株，从抗异丙基N-氨基甲酸和百草枯的细胞系也再生了抗性植株。
大多数研究，再生植株既有抗性植株，又有无抗性植株。然而，在大多数情况下不论从抗性还是从敏感再生植株产生的愈伤组织都有抗性，这表明抗性性状是可传递的，而只是在整株中没有表达。从再生烟草植株发生的愈伤组织能抗百草枯。唯一例外是，从一棵植株产生的愈伤组织对于百草枯抗性很明显是镶嵌的。在这种情况下，愈伤组织也可能发生于植株的敏感部分。
从秘鲁番茄×番茄杂种的具高度再生能力的细胞系，也分离到抗百草枯的细胞系。其中4个细胞系再生了植株。其中有一个再生的植株对于百草枯表现出耐受力，而其他再生植株都敏感。然而，从植株再生的愈伤组织保持了抗性。在R1代中看到在愈伤组织中对百草枯的抗性的分离。
在所选择的对一种除草剂有抗性的一些植株或细胞系中也看到为其他除草剂的交叉抗性。在此第二个除草剂是属于相关的类别和具有相似的代谢基础。这是可以想见的。例如，抗百草枯的大豆细胞系和抗百草枯的烟草细胞系也抗有关的联吡啶类除草剂杀草快。偶然地，抗一个除草剂也会发现抗另一个显然无关的除草剂。5个抗杀草强的烟草细胞系中有2个也抗甘氨酸衍生物。相反，5个抗甘氨酸衍生物的细胞系中有2个也抗杀草强。但还不清楚植株是否也有交叉抗性。
Chaleff和Keil(1981)发现他们的抗毒草定的植株中有一半以上也抗羟基脲。在这两种情况下，抗性性状表现独立分离，表明至少发生了两个分隔的和不同的突变。如毒草定在啤酒酵母中是非诱变的，而且也没有明显的选择压力，把毒草定和羟基脲抗性连在一起，这些双突变的发生还不能理解。在第三个例子中，性状不发生分离，表明两个基因要末是紧密连在一起的，要末是相同的。
只有Chaleff进行过在体外分离的抗除草剂的突变体的遗传分析。分析过的4个抗毒草定细胞系，确定了3个连锁群。由于遗传上连锁的两个突变体起源于同一个实验，它们可能不是独立的突变。Chaleff提出，对于产生抗毒草定表型，可能涉及许多等位基因。Chaleff发现他的抗毒草定细胞系中一半以上是抗羟基脲的，他推测二者可能是增变等位基因。
(一)诱变
从细胞培养物进行选择并不需要对它进行诱变，而且许多研究者已经成功地从未经诱变的细胞培养物分离到抗除草剂的变异体；然而，诱变可增高取得稳定的抗性细胞系。我们曾在烟草细胞培养物用了各种诱变剂，包括γ-射线，短波紫外光(254nm)，和化学诱变剂(如EMS)。现只用紫外光诱变，因其快速、方便和易用。大多数玻璃和塑料都能有效地阻隔短波紫外光，因此，在紫外光源和操作者之间可放上一大块玻璃或塑料，以保护皮肤和眼睛。为保险起见可再带上眼镜和橡皮手套。
所有程序都应在无菌条件下进行。照射后的所有操作都应在只有很弱光的暗室中进行，以防止光诱导DNA修复。
需要充分悬浮的细胞。250ml三角瓶中放80ml培养基，其中的细胞已够用。发展一种以单细胞和不超过3-4个细胞的细胞团为主的悬浮培养有技术上的困难。通常需要用2，4-D，2，4，5-T和有关的化合物来增加细胞生长速度，并产生细胞的悬浮培养物，所有这些措施都会降低细胞以后的再生植株的能力。一种曾经成功地用于制备直接植板的悬浮培养技术，是迫使脆弱的愈伤组织通过一个细孔的筛子。近来发展了一种新技术，用藻朊合钙(Calcium alginale)小珠阻止细胞在悬浮培养中的运动，以得到以单细胞为主的悬浮培养物。悬浮培养可以以悬浮细胞或从过筛的愈伤组织开始。这种技术可以无需长期的继代培养或在培养中加入2，4-D等。
在一只无菌的小烧杯(50ml)中诱变。在一个处于指数生长的中晚期的培养体中，用大口吸移管把10ml细胞转到各只烧杯中。
紫外光源放在电磁搅拌器上的一个台上。在3个灯与搅拌器之间的距离为24cm。这样较弱的光是140ergs／mm2／s，培养基吸收损失不超过1．81%。中弱的和中等的光照是155ergs／mm2／s，培养基吸收率是6．45%。只用较弱的紫外光进行诱变。如果不用上述方法，必须校准紫外线的变动率，以获得相同的总照射。用254nm光专用的辐射计，把感光器放在搅拌器上，记录变量。
用紫外光诱变时，必须搅动细胞，使细胞照光均匀。在照光前用一块无菌玻璃板把烧杯盖起来。必须在暗中进行诱变，以免光修复。用照光时间长度来决定诱变程度。移掉玻璃板即可开始诱变。重新盖上玻璃板时结束。把烟草照射2min，总共为16000ergs／mm2。用溴酚蓝染料排除法表明生存率降低30%。
被照射的细胞用新鲜培养基稀释到80ml培养暗培，以阻止DNA的光修复。诱变后，必须让其生长一段时间，使诱变得以复制并表达其功能。当细胞长好后，可把其移至选择培养基中，以分离抗性变异体。另一种方法是把含有照射过的细胞的二倍致死浓度的培养基，并在选择培养基上植板。直接植板的好处，可降低在一次诱变中发生的复分离体可能性。
(二)选择技术
从培养物中选择变异体的主要问题是植物细胞长成团的倾向。除原生质体外，单个细胞的培养物实际上是不存在的。当成团的细胞培养在选择培养基上(含有正常的致死剂量选择剂的培养基)时，有些野生型的敏感细胞在选择压力下会活下来。发生这种情况需有下述条件：(1)敏感细胞产生解毒物质，扩散或运送至邻近的敏感细胞，或(2)细胞团中央的细胞不能接触选择剂。
细胞团中有敏感细胞活下来，会导致形成嵌合愈伤组织和嵌合植物体。从烟草愈伤组织得到的抗百草枯系中，鉴定到一个稳定的嵌合愈伤组织系。从中所得到的植株也是镶嵌的，叶子有的部分有明显抗性，而有的部分则明显敏感。
在抗性细胞团中如果存在无抗性的细胞，那么把细胞转移至非选择培养基上后会导致明显丧失抗性。如果野生型的细胞生长得比抗除草剂的细胞快，野生型细胞增殖而牺牲突变体。经过几次传代后，在这种类型的培养物中只会留下野生型细胞。如果进行再测定时，就会失去抗性。
选择程序的一个先决条件是测定在培养中使细胞死亡的除草剂水平。若干因子决定除草剂的毒性，而且培养物中的其他植物有毒化合物也会影响细胞，其中包括：(1)接种量的大小，(2)作物外植体来源的培养物(或植株)的生长时期，和(3)培养基中的激素水平。曾观察到，在整个生长周期中，保护细胞使其免受百草枯毒性的酶的活性变化甚大，在晚对数期达到最大水平。因此，生长周期的某些阶段的细胞比另一些阶段的细胞对百草枯更敏感。在整体植株上也看到同样类型的变化，与植物的年龄及叶子在植株上的位置有关。同样，一些叶子比另一些叶子对除草剂更敏感。因此确定发生致死的条件和总是在这样的条件下进行选择是重要的。
各种来源细胞被用于选择抗除草剂细胞系。从愈伤组织、悬浮培养物、植板的悬浮培养体和原生质体都已成功地选择到表型上稳定的细胞系。无论是直接选择，即选择对致死浓度的除草剂的抗性，或者是分步的选择程序，即在亚致死的条件下选择几次，再在致死浓度的除草剂中选择，这两种方法都用过。逐步选择方法并没有增加抗百草枯的细胞株系的频率。兹将主要选择类型述之如下。
1．从愈伤组织选择 选择稳定的抗除草剂的变异体已取得许多成功，产生抗性和敏感细胞的嵌合体的可能性极大。在选择培养基上长期继代有可能或不能消灭敏感细胞。从愈伤组织培养体选择得到嵌合体的比率低(1／24)，可能是由于没有交叉饲喂作用。至今测试的抗性细胞系中，没有一个可以支持非抗性细胞生长。
(1)所需设备。所有过程需在无菌室或超净室上进行。愈伤组织培养在125毫升三角瓶中，加入50毫升固体培养基。三角瓶用棉花塞塞上，再包上金属膜。用一只无菌的不锈钢匙转移细胞。
(2)程序，必须测定在培养中使细胞致死的除草剂浓度。大多数除草剂在大约10-4M浓度时能使培养细胞致死。应测试从10-3至10-2的一系列除草剂浓度。如果除草剂是热不稳定的，必须在灭菌后加入过滤消毒的培养基。应在没有愈伤组织能生长的除草剂浓度中进行选择，应把愈伤组织从选择培养基转至非选择培养基上，看其是生长受阻还是死亡。致死性是重要的，当测定致死性时，必须在生长周期的相同阶段转接细胞。
愈伤组织应在选择性的除草剂浓度上生长2-4周或更长的时间，生长的时间由愈伤组织生长速度决定。把愈伤组织从选择性培养基转至非选择性培养基，测定其受抑制还是被杀死了。应选择能明显地杀死野生型细胞的除草剂浓度和生长时间。这种浓度将被用于未来选择。
把一小块愈伤组织(50-100mg)转移至选择培养基上。培养在正常生长条件下。如烟草为25℃，用白炽灯或日光灯照12-14h，每二周观察一次。经过6-8周，少数培养物(对于百草枯大约为培养物的2%)会发生小的缓慢生长的区域。这种区域表现为在死细胞的深色背景上颜色较浅的区域。把小的生长区域切下来，培养在含有除草剂的培养基上。有一些愈伤组织可继续生长，可以认为是具有抗性的。有许多因子使其不能继续生长，包括外植体太小，或这一抗性变异体不能生存。在有选择因子存在的条件下，连续转代，有助于除去残留的敏感细胞。另一种方法是把愈伤组织转至悬浮培养，在选择培养基上植板。如果要再生植株，应尽快在细胞丧失再生能力前把其转至再生培养基上。
2．从悬浮培养物选择 直接从悬浮培养物选择抗性的表型是可能的。Widholm曾经成功地应用这种程序，分离出抗各种衍生物的变异体。自此以后，McDanil曾用这种技术分离出抗除草剂杀草强和甘氨酸衍生物的变异体。用悬浮培养可使培养的突变细胞处于最有利条件下增殖，而且分离到单个突变体的可能性增加。得到嵌合体的可能性减少。这种系统不足之处是，无法知道在同一瓶中发生一种突变事件还是发生多种突变。从一个瓶中分离到的所有无性系必须按一个突变处理。
(1)所需设备 细胞需在250ml三角瓶或用Bellco三重具塞振荡瓶，放有80ml液体培养基在回转振荡器上培养。用有无菌棉塞的10ml大口吸移管转移细胞。
(2)步骤 必须用上述方法测定除草剂的半致死剂量。为得到最佳结果，需建立一种好的细胞悬浮培养。配制液体的选择培养基，把80ml培养基倒入250ml的瓶中，再把10ml细胞从处于指数生长期的悬浮培养中取出，放入选择培养基中。把细胞放在每分钟转100次的振荡器上，在标准光照和温度条件下培养。每周检查一次培养物。看起来有生长的培养物都应留下，以便进一步试验。培养物生长2-3周后在选择培养基上植板。抗性细胞会形成许多小群落，用作进一步分析。
3．从植板的悬浮培养物中选择 表11-10总结了从悬浮培养分离抗除草剂突变体的方法。细胞在非选择性的培养基中生长到对数生长期的中期或后期。在250ml瓶子中装80ml培养基进行培养。新的瓶中接入10ml生长12天的培养物。配制成选择培养基。接着把20ml选择培养基分装入培养皿(20mm×155mm)。培养基和平板必须无菌。用来悬浮细胞的选择培养基，加有除草剂和琼脂的浓度应是最终浓度的二倍，并进行消毒。用前把培养基慢慢加热以融解琼脂，在40-45℃的温箱或水浴中保持琼脂融解。培养物取样检查。如果悬浮物很细，无需过滤。如果有许多4-5以上细胞组成的细胞团，则用nitex布过滤，以除去细胞团(nitex布是一种会自动分解的布)。开始时用网眼500μm的过滤，再用网孔250μm的过滤。用70μm nitex布收集细胞，用液体培养基再悬浮起来。如果有必要浓缩细胞，可用医用离心机轻度离心，并用较小体积的培养基再悬浮细胞。为从愈伤组织获得细小的细胞悬浮体，可用孔径145μm不锈钢筛筛选细胞。把细胞倒至孔径为70μm的nitex布网上，以除去细胞碎片，并重新悬浮。或把细胞用医用离心机离心，洗后再悬浮。
表11-10 从悬浮培养分离抗除草剂突变体
取一小滴细胞混合物样品，放在血球计数板上，计算每毫升细胞数。然后调节到107-108。或者把2．5ml紧缩的细胞重新悬浮在液体培养基中。把热的选择培养基(浓2倍)和细胞悬浮培养物混匀，取10ml一份很快地倒入培养皿的选择培养基上。采用无菌的大口吸移管。培养皿用石蜡膜封口，培养在标准条件下。
每2周检查一次平板上的抗性群落。任何超过2-3mm的群落都应继代至选择培养基上。Pratt等先在非选择培养基上继代培养一周，让其生长，再加入液体的除草剂，扩散入培养基，这样可以获得较好的生存率。
4．从原生质体选择 理论上，从原生质体培养物选择抗除草剂突变体应是避免嵌合的愈伤组织和植株的最好技术，然而原生质体脆弱，需要细致和严格的操作。对此尚无文献报道。如有需要可采用D．Evans概括的程序分离和培养原生质体。
(三)再生植株
从抗除草剂细胞系再生植株应在选择后尽快进行。细胞培养时间越长，再生就越困难，也越易累积染色体畸变。当然，应注意从有形态建成潜力的培养物进行选择。
研究者们倾向于在除草剂存在下再生植株。如果愈伤组织是嵌合的(即由抗性的和敏感的细胞组成)，这种程序可以减少失去抗性的机会，因为在植株发育时，敏感细胞的生长可能会超过抗性细胞。另一方面，如果抗性特性是在细胞水平表达，而整体水平不能表达，这种程序可能产生细胞系不能再生植株的结果。已经指出，从抗性愈伤组织再生的敏感植株，可以产生抗性的愈伤组织，表明基因组仍存在抗性特性，但在整体植株不表达而已。Thomos和Pratt研究番茄杂种对百草枯抗性，也看到同样情况。另一方面，烟草的抗毒莠定细胞系再生出抗毒草定植株。
烟草Wisconsin38再生程序如下：
125ml三角瓶或婴儿食品瓶中的加4．6μm激动素和12．3μm2ip的MS培养基上再生苗。一些研究者在有除草剂存在的情况下取得再生。诱导再生培养基中所需的生长素与细胞分裂素的比例因种而异。把一小块愈伤组织转至再生培养基，愈伤组织应产生绿色区域，继而发育成苗。如果在6周内没有形成足够多的苗，把绿色区域转至新鲜再生培养基。重复这一程序，直至得到充足苗数。
把小苗(高约7．5-10mm)转移至长根培养基。通常用没有生长素和细胞分裂素的培养基。转移之前，用无菌商品生根液浸苗的下端，可能有促进生根之效。生根后，从培养基中小心地取出植株，种在潮湿的盆栽土中。注意不要伤根。从培养中得到的植物角质层极差，没有发育好的维管束系统和气孔。因此，植株“锻炼”前防止脱水是重要的。用塑料罩、玻璃杯或塑料袋把盆子罩起来即可防止失水。植株应保持潮气，但不湿。出现新叶时，在几天内把罩子去掉。在植株充分锻炼后，可移至温室供进一步研究用。
(四)测定植物除草剂抗性
表11一11总结了测试除草剂抗性的技术。从抗除莠剂细胞培养体再生的植株可能抗除莠剂，也可能不抗。有些情况下，除莠剂抗性在发育过程中明显消失。这种不稳定抗性，可能是由于后生遗传，基因组的暂时改变，或在整体植株上表型不能表达。后生遗传在功能上定义为“在正常发育中涉及一种稳定类型的细胞的变化”。后生遗传变化是在选择压力的反应中产生的，除去掉压力后可能会恢复。
表11-11 分析再生植株的除莠剂抗性
另一种可能性是，除莠剂抗性性状可能在基因组中存在，或是不能表现或是表现的水平太低不足以保护植物。一些研究者已证明，从敏感植株再生的愈伤组织可表达抗性性状。可能除莠剂抗性基因是分别活化的，即有的基因只能在愈伤组织状态表达，在分化的植株组织不能表达。也可能是，这种性状可在植物组织中表达，但在体外提供除莠剂抗性的代谢变化还不足以保护植株。例如，百草枯的毒性是百草枯还原和再氧化以后所形成的自由基的作用。百草枯的还原是通过光合作用的电子达到的。细胞培养物光合作用处于低水平，向百草枯的电子流相对较低。因此，脱毒酶水平足以保护细胞培养物的解毒酶的水平，可能不足以保护正在进行光合作用的植株，它的电子流是很高的。
如果从一个抗性和敏感细胞组成的嵌合体再生植株，也可能失去抗性。如果在非选择性的培养基上，敏感细胞具有选择性生长的优势，它们的生长可能超过抗性细胞系，产生敏感的植株。另一方面，可能由于抗性性状的多效性的，突变体表型也可能不是形态发生的。在这种情况下，只有敏感细胞可以形成植株。
测定植株抗性的程序因被测的除莠剂而不同。某些情况下，已有测定植株抗性的相对简单的方法，这种方法对植株没有损害。另一些情况下，必须用整体植株进行测试。下面列出用于测试百草枯、杀草强和甘氨酸衍生物的测试系统；然而，对每一种除莠剂都应独立进行检测。应该指出，植株和细胞培养体对于除莠剂敏感性可能是不同的，而且，对于每一种情况下除莠剂的选择水平应分别测定。
所需设备。为了测定百草枯毒性，需如下物品：(a)50厘米玻璃培养皿，(b)溶解在水中的致死或半致死剂量的除莠剂，即10-6M，10-5M和10-4M，(c)用叶子进行测定(叶子应从健康植株的相同节位取样，因为酶水平随叶子和植株年龄而变化)，和(d)11mm打孔器。此外，为了测定杀草强和甘氨酸衍生物抗性，还需要：(a)注射器，(b)杀草强溶于水中浓度为2g／1，同时加入3%吐温(Tween)20，和(c)甘氨酸衍生物。
测定百草枯抗性的程序。用打孔器从对照植株和推测的抗百草枯植株的叶片打取圆片。把叶圆片漂浮在含有各种水平的百草枯培养基上。圆片必须和溶液保持接触。培养皿上加盖，把培养皿放入培养箱，用日光灯24h照光。所有的培养皿应受到同样强度的光照，这一点是重要的。
24h和48h观察叶圆片。其反应将视光照强度而不同。通常对照叶片在24h内变白或成棕色(与叶子中的非叶绿素色素有关)。抗性叶仍然是绿的。部分抗性(忍耐)的植株由部分发白，到全部变白所需时间较长。如果需要，可用95%乙醇提取叶绿素，测定损失的叶绿素。
测定杀草强抗性的程序。选取高约30cm的植株。从植株的近顶部选取长约为5cm的叶子一片。把0．5mg杀草强(0．25ml)施于叶上。敏感植株二周内在分生组织区表现出缺绿。抗性植株不出现缺绿。
测定甘氨酸衍生物抗性的程序。选取植株和叶片如上法所叙。10-6克分子的甘氨酸衍生物(0．1ml Rounclup)施于叶子。甘氨酸衍生物能杀死植物的根。在1-2周内发生萎蔫。通常在一个月内，敏感植物死亡。抗性植物不萎蔫。分生组织区可能会失绿，但抗性植物会克服这种失绿。
(五)遗传分析
为了结论性地证明从细胞培养物得到的除莠剂抗性是否有遗传基础。必须表明这种性状可以有性生殖传给后代。对于百草枯，杀草强和毒草定已经证明可经有性生殖传递；然而只有毒草定证明无疑是孟德尔分离方式。对于毒草定抗性，已证明在3个突变体是由于单个显性基因，在第4个突变体是由于一个半显性基因。Thomos和Pratt曾经观察到番茄自交植株后代以及与敏感植株回交后代中，百草枯抗性和敏感性的分离。没有观察到正常的孟德尔分离。他们相信在番茄的百草枯抗性中涉及显性和半显性的核等位基因。有4株植物通过有性生殖传递百草枯抗性，在愈伤组织和整体植株都表达出百草枯抗性。然而，这种性状只能传给大约2%的后代。此外，自花授粉或杂交的种子有大约50%是无生命力的。无论是高水平无生命的种子和分离频率低，可能是由于在再生前长时间培养所累积的附加突变和染色体畸变的结果。因此，应该尽快从抗性细胞系再生植株。Hughes正在培养抗百草枯的R1植株，以进一步作分离测定。希望在下一轮有性生殖时会失去一些不育障碍，而保留抗性性状。
(六)抗性植株的抗性性状分离的测定
应该指出，当这种性状在愈伤组织表达，而在整体植株不表达时，必须培养所有杂交后代，还必须测定从每一后代植株得到的愈伤组织的抗性。
所需的设备，推荐如下几项：(a)选择性培养基25ml，放在150×20mm培养皿中(用不加生长调节剂的1／2MS固体培养基种子发芽)；(b)小漏斗，125ml三角瓶，清洗的水，(c)无菌水，和(d)压台板。
程序、配制含有限定量的除莠剂水平的选择培养基。取25ml加入150×20mm培养皿，进行灭菌。从抗性植株得到的种子(自交或杂交)用10%Clorox溶液洗10min。把种子倒在漏斗上的nitex布上。用无菌水洗种子。用刮舌板把种子从nitex布上刮去，重新悬浮在少量无菌水中。用水量与种子数目有关，但每只培养皿不要超过1毫升水。不断搅拌烧杯，使种子保持悬浮状态，每块平板中倒入少量水。每只培养皿用石蜡膜封边，每周检查一次，直至开始发芽，统计存活的幼苗。一旦决定幼苗有抗性，应把其转移至种子发芽培养基以利进一步生长，最后移至土中。
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