应用

出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第258页（5487字）

(一)组织培养系统中抗病性的表达

烟草／Phytophthora parasitica Dast．var．nicotianae(Bveda de Haun)(P^pn)系统是已经被很好地确定了的，它为离体培养系统应用于寄主与寄生菌相互作用研究的可行性提供了最好的证据，一个显性基因因子决定了烟草对P^pn的O小种产生的单基因抗性，这种因子在组织培养中得到了表达，Helgeson等(1976)把由185个烟草植株切根与其产生的愈伤组织进行观察比较对P^pnO小种的抗性反应。供试植株的切根，分别来自纯合有抗性亲本，纯合敏感亲本，这些亲本杂交得到的F₁，敏感和抗性的植株分别自交产生的S₁植株，由F₁自交得到的F₂植株，纯合的敏感植株与杂合的抗性F₂植株杂交产生的F₃，以及F₁植株与从栽培品种Wisconsin38产生的敏感植株的异交后代。在每种情况下的分离模式，反映了对P^pnO小种产生抗性的显性单基因因子的存在。此外，从有抗性植株来的愈伤组织具有抗性，而从敏感植株来的是敏感的。既然这些植株和由其得到的愈伤组织对P^pn的O小种的反应总是一致的，那就证明在整体植株中表达的抗病基因在组织培养中也能表达。在组织培养中数量遗传对P^pn的抗性也得到了表达。Deaton等(1982)发现由田间(水平)抗性的burley栽培品种植株产生的愈伤组织对P^pn的反应是与整体植株对病原菌的反应高度一致的。这些愈伤组织的抗病能力处于单基因抗性与敏感性之间。

烟草愈伤组织培养体的抗性表达是受好几个因子影响的：包括温度、接种浓度、愈组织形态学，特别是培养基中的植物激素的平衡。有抗性反应的愈伤组织在接种点以下表现出过敏反应，伴随着由病原体引起的克隆化减少。在敏感组织中没有观察到任何过敏反应，在接种后七天内有广泛的克隆化。细胞学研究表明，在接种后的48h内，抗性组织中只有5-8层细胞被穿过，而在敏感组织中则有50多层细胞被克隆了。在组织培养中，亲和的和不亲和的互作中的亚显微结构变化，明显地相似于受P^pn感染的完整根中的变化。

在组织培养中抗性的小种专化性的表达，通过马铃薯对Phytophtlrora infestams(Mont)的反应，也得到了证明。由品种Majestic来的组织培养复合体，没有任何已知的抗P．infestans的R基因，能促进病原菌小种4的生长，而由品种Orion来的含有R₁基因的复合体则不起促进作用。茄属的另一些抗小种4系来的组织培养复合体也具有抗性。而那些敏感系来的也是敏感的。因此，Ingram(1967)得出结论，抗P．infestans的R基因在茄属的组织培养体中得到了表达。如同烟草／P^pn系统中，马铃薯愈伤组织中抗P．infestans的基因的表达，也受培养基中生长调节剂平衡的影响。通过调节培养基中的生长素／细胞分裂素的比例，Campbell(1979)能够证明愈伤组织中对P．infestans抗性的表达。尽管P．infestans确实引起烟草愈伤组织的褐化，但抗性反应并不是与组织的褐化相伴随的。

其他研究过的抗病性表达的组织培养系统包括(a)番茄(Lycopersicon esculentumMill)／P．infestams；(b)大豆(Glycinemax(L．)Merr)／Phytophthora megasperma Drechs．Var．sojae；(c)烟草／Pseudomonas spp．和(d)烟草／烟草花叶病毒。

此外，利用苜蓿愈伤组织系统分别研究苜蓿对Phytophthora megasperma f．sp．medicaginis(Pmm)，一种苜蓿根的病原菌和P．megasperma f．sp．glycinea(Pmg，syn．P．megasperm Var．so．jae)，一种大豆的而不是苜蓿的病原菌的寄主和非寄主抗性。栽培苜蓿是具有相当大的基因多样性的同源四倍体，它的遗传性很复杂。看来一个以上基因系统控制着苜蓿对Pmm的抗性；在这种系统中，抗性是由两个不完全显性互补基因决定的，抗性的表达，至少需要在一个基因位点上有一个双显性组合基因型，而另一座位点上有一个单显性组合基因型。在组织培养中有对Pmm抗性的表达，也有对非病原菌Pmg抗性的表达(表12-1，图12-1)。组织克隆化的降低和组织褐化的增加，标志着抗性反应，与敏感性反应相对而言。在接种后两天内，根据存在于接种的愈伤组织组织块上气生菌丝，表明抗性和敏感性互作间有所不同。

图12-1 接种Pmm或Pmg72h后，苜蓿愈伤组织克隆化

表12-1 接种Pmm或Pmg后苜蓿愈伤组织系中气生菌丝发育和愈伤组织变色

0=无菌丝或不变色 1=25%愈伤组织块有菌丝或变色 2=50% 3=75% 4=全部长有菌丝或变色M26 9系感Pmm，M₁₉₄系抗Pmm，两者皆不是Pmg的寄主。

(二)组织培养中植物抗毒素的诱导和生物合成

植物抗毒素是种低分子量的抗微生物化合物，是植物在对各种有毒物质和无毒物质处理作出反应的产物，在抗病过程中，它被认为起有一定作用。近来，组织培养特别是悬浮培养系统，已在不同方面被用于研究植物抗毒素的诱导和生物合成。生长于培养条件下的细胞，保留有对各种生物、非生物的抗毒素诱导剂的反应，而产生植物抗毒素的能力(表12-2)。在有些情况下，植物抗毒素是在没有诱导剂存在时产生的。但总的来说，在组成的或非诱导的培养体中产生植物抗毒素水平是不高的，而且随连续继代培养而降低。

表12-2 用于不同寄主-病原体反应的抗病性表达和植物抗毒素积累研究的组织培养系统

组织培养中植物抗毒素诱导的研究大多包括豆科一些植物产生的异类黄酮衍生的植物毒素。经孢子悬浮液或其他诱导剂处理后，已在菜豆、大豆和洋刀豆中检察到培养物中苯基丙酮类代谢的各种酶水平的变化。L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化由苯丙氨酸合成苯基丙酮类抗毒素的代谢的第一步反应。在以诱导剂处理的愈伤组织或悬浮培养系统中，它的活性增加，先检系统中抗毒素浓度的升高。以用大豆病原菌Colletotrichum lindemuthiarum(Sacc．& Magn．)Br．& Cav．制备的诱导剂处理悬浮培养的豌豆可以见到很明显的却又是短暂的PAL酶活力的增加，这是因为酶的重新合成。但是，在植物抗毒素合成中，PAL酶是否起着决定性作用还不清楚。还有一个苯基丙酮类代谢中的酶，在诱导的愈伤组织或悬浮体中也观察到有活性的增加，这些酶是：(a)C．ensiformis中的O-转甲基酶；(b)大豆中的二甲磷丙基焦磷酸酯(dimethylallypy rophosphate)；3，6，9-三羟基-紫檀二甲烯丙基转移酶(3，6，9-trihydroxypterocarpan dimethylallyl transferase)和(c)豌豆的桔酸4-羟化酶，P-香豆酸一辅酶A(一种连接酶)，黄烷酮合成酶和苯基苯乙烯一黄烷酮异构酶。

(三)植物抗毒素在组织培养物抗性表达中的作用

在整体植株中的一些仔细的研究表明，植物抗毒素在适当的时间、空间达到适当的浓度时，就会限制不亲和小种的病原菌生长。因此它被说成为在小种专一性的抗性表达上起决定作用。但是，在烟草愈伤组织中进行的对P^pn的不亲和小种产生抗性的研究未能提供支持这一观点的证据。在烟草愈伤组织中，具有抗真菌活性的Rishitin Capsidol及两个有关的倍半萜化合物，在以P^pn能亲和的和不亲和的小种分别处理时，在烟草愈伤组织内都有增加。但是在亲和的比不亲和的浓度更高，且能更早检测到。尽管在接种后24h内，菌丝的生长就受到抑制，但直到接种后60-70h才在不亲和反应中检测到植物抗毒素。这样看来，在这种系统中，抗毒素如何对小种专一性的抗性表达发生作用还不清楚。

在苜蓿愈伤组织对Pmm产生抗性时，研究了植物抗毒素作用，得到相似结果。目标集中在Medicarpin上。它是苜蓿根和幼苗在Pmm刺激下，和在非苜蓿病原菌Helmintlrosporium carbonum Ullshup的刺激下，积累起来的占优势的植物抗毒素。虽然具有抗性的愈伤组织(M194)，在Pmm刺激下，比敏感愈伤组织(M269)的克隆化程度要明显较低。在抗性反应中Mediearpin的水平却比在敏感反应中的要低。另外，在抗性愈伤组织达到的Mediearpin的最高浓度(约20μg／g新鲜愈伤组织重)，比离体培养条件下测定的Pmm菌丝抑制生长的生物检测决定的ED50值(＞90μg／ml)要低得多。

另有报道，苜蓿叶子接种H．carbonum后，有另二类异黄酮类植物抗毒素(Sativan和Vestitol)的积累。无论是以Pmm或Pmg刺激苜蓿的愈伤组织还是不接受任何病原菌的情况下，都还没有发现Vestitol。在以Pmm或Pmg刺激的愈伤组织中，接种后48h内，可测到有低浓度的Sativan(2．5μg／g愈伤组织鲜重)，接种后72h以前，可观察到其浓度有较小增加。Sativan的积累象Medicarpin一样在敏感反应中最高。这样看来，在苜蓿愈伤组织对Pmm的抗性表达中，植物抗毒素的积累是不起什么作用的。但是，植物抗毒素可能对苜蓿愈伤组织对Pmg的非寄主抗性有所作用。以Medicarpin抑制菌丝的离体培养试验生长表明，Pmg对这种植物抗毒素是高度敏感的(ED50<20μg／ml)。用Pmg接种后72h，M269和M194愈伤组织都有Medicarpin出现，且浓度超过了它对Pmg抑制的ED50值。

烟草／P_pn和苜蓿／Pmm组织培养系统中，不能证明植物抗毒素在寄主抗性表达中占决定作用，并不能当作结论性的证据来否认植物抗毒素在整体植株抗性表达中的作用，我们需要在整体植株和组织培养条件下，平行地研究抗病性问题，以确定在两种情况下抗病机制是否一致。而利用组织培养进行研究未能支持植物抗毒素的概念，这就表明对这一概念还需要作更仔细的研究。组织培养系统提供了一种手段，利用它可能可以对其他可能的抗病机制进行研究。

【参考文献】：

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