低压保存的程序
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第284页（5630字）
干燥贮藏法和低温保存法，也包括低压和低氧贮藏。通过降低植物组织培养物周围的大气压力以形成低压系统(LPS)，可使与植物材料接触的所有气体的分压均降低(图13-2)。而低氧系统(LOS)则是在大气压下(760mmHg)，通过加入惰性气体如氮气，使O2分压降到预定大小。用LPS和LOS对植物组织培养体进行实验所得结果表明，不管是植物的某一部分，还是整株植物，两者均可同样使用(表13-4)。
图13-2 正常大气贮藏、低压贮藏和低氧贮藏的比较
表13-4 用低压和低氧处理植物组织培养物实验结果
对所有的植物组织培养材料都能适用的通用贮藏法还未找到，但用低温(4℃)进行短期贮藏已在许多植物中获得成功。冰箱贮藏草莓植株已被应用，但此法有些缺点，应用受到限制，培养基仍需周期性地更换，脱水后的细胞可能会衰退，植物材料的淘汰也会发生，因此，在细胞开始受损之前，必须将培养物从贮藏状态下取出。
低压贮藏可广泛地用于肉、家禽、虾、鱼类、蔬菜水果、切花、盆栽植物、插条以及其它有代谢活性物质的保存，它也成功地用于许多园林作物生理、病理方面的控制。低压保存具备如下条件：首先，农产品必须置于有温度控制的大气中；其次，大气压力必须降低，并使贮藏室和农产品中各气体分压低而与农产品中各气体交换引起增加的压力相当；第三，空气要不断更换，以带走释放到贮藏空间中的有毒气体；最后，要保持高的湿度，以防农产品的干缩、失重和脱水。
前人工作表明，低压有可能成为植物组织培养体长期保存的有用工具。首先可看到，一些通常短命的种子，如洋葱、芹菜、甘蓝等，经低压贮藏后，其萌发率反比贮藏于大气中的要高，其后实验又表明，番茄的生长受到低压的控制。
低压除了可用于长期保存法外，它还有其它的优点。它能降低无菌材料及培养基里病原菌的活力。绿青霉、构桔蒂腐菌和菌核病菌的孢子萌发、菌丝体的生长以及孢子形成能力在低压下均将下降。还发现，低于大气压的压力同样对扩张青霉、黑根霉、黑曲霉、葱腐葡萄菌和交链孢霉都有抑制作用。
低氧贮藏是在大气压下按需要，将不同的气体组合成一种新的环境。早有报道，在低氧和高二氧化碳下贮藏苹果和梨，而现在在商业经销中，该法仍用于贮藏各种水果。
为什么低压和低氧贮藏能延迟园林作物的衰老，有如下几种解释。一种认为，由于降低了氧的分压，因而二氧化碳的量也减少，并由于温度较低，呼吸作用也减弱；另一种认为，在低氧下，由于空气不断流动，带走了有毒气体，如乙烯(它可能积累)，从而延迟了衰老。
大多数植物生长与氧气关系的研究，都涉及到光下氧的吸收和二氧化碳放出量的测定。以此也能解释低氧影响植物生长的道理。研究表明，当空气中氧减少时，光合作用加强，因为氧气对光合作用碳循环中的RuBP羧化酶有直接的抑制作用。同样，当氧气分压降低时，光呼吸也可能下降，这将抑制CO2的产生，而可能促进CO2的固定。Hesketh(1967)发现光合作用的加强和光呼吸的减弱取决于物种和温度，如在小麦和大麦中观察到的，气孔的关闭是需要氧的。因此，低氧分压同样会影响蒸腾。
低氧分压可用于植物组织培养体贮藏的想法是由Caplin(1959)提出的，当时，他注意到矿物油能广泛用于各种微生物的保存，矿物油可用来减慢生长速率和减少琼脂培养基中的水分蒸发。Caplin以胡萝卜为材料所做的实验表明，在油下或者在培养液中的组织，其生长量是由其中氧的供给所控制。
Bridgen和Staby(1981)用LPS和LOS所做的实验，首次报道用低氧气压来保存植物组织培养体。他们曾研究了已分化的培养体：烟草、菊，未分化的培养体：烟草(同一品种)。
菊花幼苗的生长是通过鲜重(表13-5)、高度的增加(图13-3)以及叶片总数(表13-5)来测定的。以不经处理的植株作对照(生长6周)，其结果生长量是不同的。用氧分压(PO2)为50mmHg或更高处理，贮藏6周后与对照无区别；用低于50mmHg(PO2)处理，植株即使生长超过6周，但其生长量也比对照低。当植株生长在LOS和LPS下，且两者的氧分压(PO2)相当时，其生长特点相同。
表13-5 菊贮藏36周后的平均鲜重和叶子数
a．S．E(标准误差)=0．01．
h．S．E=1．81。
烟草茎尖生长是通过计算叶和根的数目和植株高度来测定的。表13-6所列具体等级系统是用来表明结果(表13-6)。其生长趋势与菊花中所观察到的结果相似，随PO2的下降，生长率也降低。同样，PO2越低，生长越减缓(表13-7)。实验发现，只有用LPS处理，在压力为40mmHg，2周后培养基有干燥现象出现，引起了50%的瓶内植株失水，以致中断了一组重复的生长测定。
表13-6 鉴定组织反应的具体等级系统
表13-7 烟草幼苗贮藏6周后的具体比例
a．该数据是用一组重复测得的．
烟草愈伤组织的生长，是通过测量高、宽度的增加来计算体积(cm3)增大鉴定。开始时体积是125mm3组织块(图13-4，13-5)愈伤组织的生长曲线同分化的菊、烟草组织相似，但经不同处理后，差异却更加明显。当PO2下降，生长减缓，而用LPS和LOS在相同PO2下，两者无差别。
图13-3 贮藏六周内，菊的高度增加C．E=1．71
图13-4 在低压贮藏2、4、6周后，烟草愈伤组织体积增加量
图13-5 低氧贮藏2、4和6周后，烟草愈伤组织体积增加量
三分之一的菊花和烟草植株在贮藏6周后仍能开花，这些植株首先被转接到含有1．1μM IAA和0．93μM KIN的M S培养基中，4周后，将植株移植入盆中，并置于有喷雾和长日照条件的温室中，2周后植株放在标准的温室条件下生长。不同的处理、生长习性以及最终高度几乎没有差异(表13-8，13-9)。
表13-8 菊花先在低压和低氧条件下贮藏6周后，移至温室中生长40天后的平均高度
a．S．E=标准误差。
表13-9 烟草先在低氧和低压条件下贮藏6周后，转至温室中生长150天后的平均高度
a．S．E=标准误差．
Bridgen和Staby(1981)，用下法制备的植物材料进行研究。菊花先生长在温室中，日照为16h，待高度达到15cm时摘心，将摘下的侧芽，浸在次氯酸钠中15min，用50%酒精漂洗1min，然后保存在0．26%次氯酸钠中，直至进行培养接种为止。这些营养芽作为材料放在瓶中，每次实验从中取下0．5mm长的茎尖。烟草的起始材料可取于已有的培养瓶中的无菌苗。所有的培养物都可生长在30m1方形玻璃瓶中，内装改良的MS培养基，对菊花另加0．11μM IAA和0．93μM KIN；烟草幼苗另加1．1μM IAA和0．93μM KIN；烟草愈伤组织，另加入4．5μM2，4-D和100ml／L椰乳(CW)。培养基经高压灭菌(121℃下消毒12-15min)。实验之前，先把瓶塞完全松开，但它仍放在瓶口上，以便有适量的水分交换。
实验时，每种处理16瓶，重复两次，处理材料置于相同条件下生长，26-28℃，用冷白荧光灯加光16h，光强2．0-2．24lx，将每组处理保存在10L大小的干燥器中，再把干燥器放在透明的聚乙烯袋中，干燥器在实验前用次氯酸钠液进行表面消毒。
低压系统可用精密科研75型真空泵来产生。空气经过KMnO5，滤器，以除去各种碳氢化合物，包括乙烯，然后通过MathesonModel9型压力调节器调节空气流量表、水浴，最终达到干燥器(图13-6)。在带有侧臂的1L锥形瓶中加350ml蒸馏水成水浴，大气通入水浴，可使相对湿度维持在94-96%，水浴的温度比室温高3℃，以使容器内湿度保持最大。每种LPS处理，气体流速可按水银气压计中的读数来调节。
大气调控系统是由O2、N2组合而成。让它们通过水槽使气体从水里冒出，以使湿度达60-70%。每种气体的压力要保持恒定，并通过不同大小的玻璃导管来控制进入系统中每种气体的百分含量。大气中的气体组成可通过Packer气体导热色谱仪在烘箱温度100℃和喷嘴及指示器温度170℃下测得。对O2和N2，需用5Å，60／80目分子筛来装填3mm×90cm的不锈钢柱。开始时，每次实验每天都需抽出3ml气体样本进行分析。但当一个大气系统制成后，只需1周测试1次。
对照是通常大气压，相对湿度约94-96%。所用的系统与前述的低压系统相同，所有的气体都经过KMnO5，滤器过滤，空气的流动通过1．3amp空气泵来维持(图13-6)。
图13-6 图解低压系统(a)；大气调控系统(b)；以及大气压系统(c)
实验中，6周后的污染率从未超过10%，主要是因为保持着无菌状态，同时低氧也是成功的因素．
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