甘蔗
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第680页（14309字）
甘蔗是禾本科(Gramineae)Andropogoneae族甘蔗属(Saccharum)的一员。该属的种通常是高度多倍体，没有二倍体(2n=2x=20)。染色体数异种变异性和保持非整倍体是其特征。有5个种：印度甘蔗(S．officinarum L．)，2n=80，是闻名的“杰出”的蔗；甘蔗(S．sinense Roxb和Jeswiet)，2n=106-120，叫“中国蔗”，是Roxburgh(1796)从中国广东采集的，S．barderi Jewiet来源于印度北部，Barber(1916)分成5群：Sunnabile(2n=82-116)，Mungo(2n=82)，Nargori(2n=107-124)，Saretha(2n=90-92)和Panshi。Jeswiet(1925)把它者归入S．sinense，有二个自然品种：Chunnee和Saretha S．spontaneum L．，2n=40至128，台湾广泛种植品种2n=112；S．robustum Je-swlet，2n=60至800。S．robustum与S．officinarum和S．spontaneum组成现代甘蔗商业品种的亲本品系。
Brandes(1956)提出马来西亚(新几内区域)是S．officinarum的初级变异中心。现代大多数甘蔗商业品种是甘蔗属内异种间杂种后代。也曾报道过甘蔗与其它属(Erianthus，Miscanthus，Narenga和Zea)的异属间杂种，但在农业上无重要价值。
甘蔗是国际的输出和内销重要农产品。1980-1981世界糖产额为86．97Mt，其中61%是甘蔗产品(甘蔗属杂种)。巴西、古巴和印度是主要生产国。
Arcenaux(1967)总结80年来甘蔗育种品种指出，现代商品甘蔗基本上来源于80杰出的种质，和少于10 S．spontanum衍生种。育种家认为商业品种遗传基础过窄，急需寻找增大遗传变异性。
利用愈伤组织细胞在培养中产生遗传变异的能力，已取得了许多农业上有用的愈伤组织产生的植株。如甘蔗抗黄济病毒和黑穗病真菌(Ustilago scitaminea)，和高产、高蔗糖植株。证实了可用组织和细胞培养技术，作为甘蔗改良的手段。
(一)研究进展
Nickell(1964)1961年在夏威夷开始甘蔗组织和细胞培养研究，Heinz等(1977)和Liu(1981)评述了它的历史(表26-1)。1970台湾糖业研究所(TSRI)应用组织培养于甘蔗改良。Fiji与澳大利亚进行了Fiji病毒和眼斑真菌抗病选种。Florid，菲律宾、巴西和法国也研究甘蔗组织与细胞培养。
Heinz与Mee(1968)首次报道愈伤组织诱导和芽分化。Nickell与Maretzki(1969)从事悬浮培养，夏威夷学者用此补充了几种营养和生化研究。Liu等(1982)首次检定了幼叶和近端分生组织外植体的愈伤组织细胞的启动位置。Liu与Chen(1974)首先发现几乎全部禾本科作物愈伤组织内作为芽分化模式的为叶原基包围着的顶端分生组织图案。Nadar与Hei-nz(1977)曾提出MS培养基附加NAA26．9μM，可促进再生芽形成根，但未被其它实验室所证实。Liu(1981)用SH培养基不加生长素诱导分化的芽生根。Liu与Chen(1974)，Nadar与Heinz(1977)确认芽和根独立发生，对营养培养基要求不同。Maretzki与Nic-kell(1973)首次分离甘蔗原生质体，并诱导形成细胞团。继而，Chen与Shih(1983)能以取得从悬浮细胞的原生质体产生愈伤组织。Liu与Yeh(1982)首先从生理逆境研究中，用植板技术选择耐NaCl0．26M细胞系。Vasil等(1979)是第一组学者建立甘蔗愈伤组织与固氮细菌(Azospirillum)间的联合，研究试管内固氮。陈建华等，1979年报道了甘蔗花药培养再生绿色再生植株。Krishnamurthi(1974)首先用细胞培养方法获得抗病植株。更重要的是Liu与Chen(1978)在甘蔗细胞培养家中为首取得几种高产与高蔗糖愈伤组织产生的无性系(表26-1)。
表26-1 目前成功的甘蔗细胞培养研究
1．诱导遗传变异性 广义上愈伤组织培养是诱变因素，随着愈伤组织细胞长期保持在人工培养下，通常细胞学上不稳定，再生植株常出现遗传变异性。分化植株的培养的细胞发生的遗传变异性研究，着重分析染色体数，形态性状和同工酶模式。
(1)悬浮培养 Heinz等(1969)报道甘蔗悬浮细胞染色体有变异，大多数是非整倍体。Liu等(1977)在品种F184悬浮培养细胞中发现染色体数变动在2n=92到191，平均111，供体的是108。Liu与Shih(1982)观察其它栽培品种如F156、F166和F167，有同样染色体数变异。
(2)再生的植株 Liu与Chen(1976)研究8个体细胞无性系(一个名词以区别于组织培养产生的再生植株)群体的形态性状，发现以叶耳长变化最明显，其再生植株与供体克隆的相比增长8．6%。下垂(dewlap)状6．5%，毛丛6．2%，叶姿态1．9%。形态性状变异频率视基因型而异。Heinz与Mee(1971)观察到同样结果。
F156体细胞克隆染色体数从2n=86到126，供体为114。F164的2n=88到108，供体108。F146产生的植株为2n=104到118，供体110。Heinz与Mee(1971)发现H50-7209产生的37个体细胞克隆2n=94-120。
Thom与Maretzki(1970)用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究再生植株遗传构成的同工酶模式。体细胞克隆系70-6132(从cv、F164产生的)，与F164相比，少了二条酯酶带，其它体细胞克隆与供体组织的相同。从一个育种选系81-1243产生的三个变异体C1，C2和C3的酯酶谱分别少2，3，和1带，供体有11条带。
2．取得农业上有用变异体
(1)高产变异体 1974以来，每年进行选择的体细胞无性系重复的大田试验，以筛选高产系。
1974-1975结果指出，70-6132比供体F164，较高的蔗量(32%)、糖产量(34%)和秆数(6%)。Liu与Chen(1978)指出蔗和糖产量达到5%或然率水平的显着度。
F160衍生系中，74-3216表现好，进行地区大田试验。74-3216蔗量比供体的高6%，糖产量10%，秆数6%。F160产生的体细胞克隆75-3070比供体的蔗和糖产量各高8%和15%。可见利用体细胞克隆变异，可选出愈伤组织产生的农业上有用植株。
(2)高蔗糖变异体 比较了选出的高糖体细胞克隆与其供体的蔗糖含量。以71-4829系为例，其蔗糖含量稳定地较高于供体(H37-1933，最先取得的体细胞克隆)，达到1%或然率水平显着度。75-3070与F160相比，结果相同。75-3070对菌核病感病。
(3)抗病变异体 1970年开始，Krishnamurthi(1974)与Krishnamurthi与Tia-skel(1974)开始筛选许多品种的体细胞克隆对斐济病(叶跳虫传播病毒)和粉霉病(Scle-rospora sacchari)的反应。从感Fiji病品种产生的300个体细胞克隆中，4个抗病，1个中等抗病。同样，粉霉病抗性选择中，产生了比供体具有较高抗性的变异体。有些Pindar体细胞无性系，兼抗斐济和粉霉病，已在Fiji进行产量试验，并在澳大利亚进行独立试验。这些系的糖产量不比Pindar的低，事实上，有些系的产量稍有增高，虽然统计上相差不显着。
Larkin与Scowcroft(1981)测验了从感眼斑病(Helmin thosporium sacchari)感病克隆viz、Q101产生的260体细胞无性系的抗病性。发现了有8．9%高抗或近于免疫。这些无性系在形态上与供体系无别。
栽培品种F177是台湾1980-1981期间的第二号商业品种。它高感黑穗病。在供试的9个体细胞克隆中，有一个76-5530染病率仅为43．8%，而供体为88．2%。其蔗糖含量也稍高。
(4)耐盐性细胞系 把栽培品种F164悬浮细胞培养在附加NaCl的系列液体MS-C培养基中，NaCl浓度每次继代以0．02M增高，继代4-8次。无论启动时用的浓度如何，或继代几次，全部培养体只能耐0．16M NaCl。当细胞不再生长时，植板在附加0．17M和0．26M NaCl的琼脂固化MS-C培养基上。培养50天内，99．9%以上细胞为盐高浓度所杀死。可是有极少数细胞团成活，长成小克隆。以在0．26M NaCl植板能生长的克隆叫0．26M NaCl选系。
耐盐细胞系有二种特征：1．它在高盐培养基上长得较快。用该选系与未经选择的原来群体的细胞系，接种在附加不同浓度(0，0．086M，0．17M，和0．26M)NaCl MS-C培养基上。培养40天后，测定其生长指数。结果指出在不加NaCl时，耐盐细胞系的生长比未经选择的为慢，但在0．17M和0．26M NaCl上，则较快。2．耐盐系吸收Na+和Cl－较多。耐盐愈伤组织吸收K+较少，但它的Na+和Cl-比对照高得很多。
Liu与Yeh(1982)提出，由此可见盐选细胞系内，发生了朝向耐盐的嗜盐性的普遍变迁。
3．用化学和物理的诱变剂诱导遗传变异性
(1)秋水仙素 用0．25mM秋水仙素处理cv．F164悬浮细胞，其染色体数增至每细胞309条，几为供体(108)的3倍。同法处理一个选系61-1248克隆，秋水仙素处理的细胞再生成三株变异体，即61-1248-C1，-C2和-C3。其染色体数增至2n=156，与供体104相比较，它们是非整倍体。植株矮小和长势差。Heinz与Mee(1970)用同法也取得了46变异株，其中22为多倍体，2混倍体，和22二倍体。
(2)γ射线 具有许多绿芽原基的cv．F177愈伤组织，用不同剂量的γ射线辐射。将经8，12，14和20krad辐射的愈伤组织，转移到MS-D56培养基上，供继续生长。愈伤组织切成0．5cm2小块，以相距2×2cm接种在薄层(3-4mm)MS-c培养基上，此时每块愈伤组织上约有10-15绿瘤(小芽)，培养1月后，观察之。
生长在MS-C和MS-D56培养基上的芽生长反应不同。由于MS-C加高水平生长素(13．6μM2，4-D)，即使经16krad处理，芽生长正常。8krad有刺激效果。而在MS-D56上，生长差，易受辐射剂量之害。生长在MS-D56的芽的LD50为10krad，而生长在MS-C上，经20krad也很少损害(Liu和Chen，1981)。在二种培养基成活芽，均能长到成熟，在其后代中将针对黑穗病进行选择。
(二)愈伤组织培养物的培养程序
1．茅再生 采用的组织常用(a)近端分生组织，包含第1-8节间，(b)围着茎端的第2片幼叶，切成长2，0-2．5cm，和(c)未抽出花序。
(1)培养基 MS营养成分，附加各种维生素和生长调节剂，见表26-2变换MS培养基以启动愈伤组织和再生芽。用改进SH培养基从再生芽上生根。
表26-2 诱导愈伤组织和芽与根分化用的培养基a
a．台湾糖业研究所用，b．改进Murashige与Skoog(1962)培养基，c．改进Schenk与Hildebrandt(1972)培养基。
(2)取材步骤 由于顶芽和卷曲幼叶深裹在叶鞘内，是无病原菌的，这些外植体不需灭菌。剥去外层叶鞘直至第十节。仔细剥到叶鞘节，直至只留最内层第一、二片叶鞘仍包着芽尖。取出芽尖顶帽与2cm幼叶，立即接种在MS-C。芽尖顶帽常渗出棕色物，Liu(1981)讨论了防止法。
(3)培养条件 26-28℃，冷白荧光，光强3800lx，光周期12h。
(4)启动愈伤组织 接种后4天，愈伤组织启动。叶外植体愈伤组织来自初生韧皮部薄壁细胞，芽尖顶帽则源于初生韧皮部。培养6周后，积集了相当大愈伤组织团。芽尖顶帽、幼叶和幼花序三种外植体，产生愈伤组织和再生植株最高频率的是幼花序。
(5)愈伤组织的利用与保持 生长4-5周后，将每块愈伤组织分装二个培养瓶，一装MS-C，以供愈伤组织增殖，另一装MS-D56以供植株分化。
(6)芽再生的顺序进程 根据目前对人工培养下植株再生的概念，提出二种途径∶(a)器官建成产生芽，和(b)体细胞胚胎发生。甘蔗愈伤组织芽和根分化过程的组织学测验。根据器官建成和胚胎发生的区别，似乎对目前已报道的甘蔗形态建成不适于采用胚胎发生一词。为此，叙述从甘蔗愈伤组织块分化芽过程的步骤。
供试材料是cv．F162未成熟花序产生的第3或4次继代的愈伤组织。用石蜡切片法。
MS-C(含13．6μM2，4-D)愈伤组织中央部分常有相对大薄壁细胞，在周缘带内具有紧密小细胞，特征是等直径形，染色深核，与Gautherat(1959)所见相同。偶有周缘区若干部分发育成分生组织中心。当将生长在MS-C上的愈伤组织转移到MS-D1(MS不加2，4一D，加0．35mMdalapon)，再生长16天，在周缘区域形成许多瘤状类分生组织。认为后者是从已有分生组织中心发生的。进一步生长(继代后23天)，它们逐渐发育成芽尖，每个芽尖中央具有顶端分生组织，围以叶原基。这与甘蔗茎尖很相似。此时，从愈伤组织表面出现许多绿点。再生长3-5天，幼叶长得较大时，茎尖为类胚芽鞘结构所遮盖。继代后30-35天，茎尖发育成茎芽。茎芽叶状和肉质的。与甘蔗种子长成的芽不同。茎芽逐渐增大，最后盖满愈伤组织表面。当芽长到1．5-2．5cm时，将芽丛移至改进SH培养基上，诱导生根。每个培养瓶通常有20-25再生植株(30×150mm，装琼脂培养基13ml)。
(7)增高芽再生频率 初期用MS-D1为分化培养基。每次继代(4周一次)的再生率只有13．5%。试验表明50甘蔗栽培品种计算平均3500单位结果。芽分化以第二次继代(以启动外植体培养为第一次转移)再生频率最高。以后逐步下降，通常到第8次继代终止。为了增高再生频率，MS必需附加各种生长调节剂。其中，MS-D56把再生频率从13．5%增到24．2%。MS-D56成分除不加dalapon外，余同MS-D1，加5．3μM NAA，4．65μM KIN和400mg／lCH。再生能力也能延长到第十一次转移，但以后极少再生芽。
2．根再生 甘蔗再生期间，芽与根独立启动。移到MS-D127天后，有些愈伤组织再生。在显微镜下观察这种愈伤组织，可见根原基早在继代后14天时形成。可是，有根原基的愈伤组织很少分化成芽。所以，在再生中的愈伤组织中，未能发现胚-幼根轴结构。另一方面，大多数栽培品种的再生芽，生长在MS-D1上，难于生根。为此，需设法促进根的启动。
测验改进SH的芽再生促进能力时，偶尔发现愈伤组织上长了许多根。经取这种愈伤组织切片显微镜观察，早在继代后13天已发育成许多弱根，提出不加生长素SH，可能对诱导根有效。因此，将长到明显可见新生芽时，移至改进SH上。50天后，从芽(茎)冠诱导产生大量的根。从此常规地采用改进SH为从芽生根的培养基。
3．幼苗移栽成功 当再生植株在瓶内长到高6-9cm时，移到
石钵，每隔一天浇Hoag1and溶液一次。达15-18cm时，移栽泥土苗圃。再经4-6周，可移栽大田，行距1．37m，株距35cm。应将供体植株栽于邻行。
(三)愈伤组织产生的植株的选择
1．测定染色体数 把从愈伤组织产生的植株的花粉母细胞，幼小穗，用Farmer氏固定液(95%乙醇∶乙液=3∶1；Evans与Reed，1981)固定，4%铁乙酸洋红染色，计数染色体数。体细胞则用Price(1962)叶涂片法测定。每株取样5-10个细胞。
2．产量试验 愈伤组织产生的植株，无性繁殖第二年，和它们供体的切枝，秋季种成8行(行距0．35m)，每行面积为6×1．37m。随机区组，重复2-3次。种后12-16个月收获蔗茎。资料作变量分析。
3．蔗糖分析 用手持反射仪测定每株大田Brix值。选取Brix值高的系，用蔗糖手册(台湾糖业研究所1956)所述程序进行化学分析。由于糖量受环境(如温度、土壤湿度，年龄和取样技术)的影响，常将愈伤组织产生的植株与供体邻行种植，同时测取大田Brix或蔗糖百分资料，以保证可靠的比较。为了测定平均含糖量，全部高蔗糖系进行成对测验(愈伤组织植株与供体)。
4．抗病性测验 目前着重于黑穗病抗病性测验。从高感克隆产生的新植株，例如F177，用Leu与Teng(1974)的愈伤糊料法(wound-paste method)测定。用x2法分析资料，以测定愈伤组织植株与供体的黑穗病侵染差异是否显着。
(四)悬浮培养程序
细胞悬浮培养曾用于研究植物细胞生理学的，生化的和代谢特性。目前采用细胞培养着重于初级和次生代谢产物的生产。Jtreet(1973，1977)Fowler(1977)Kibler与Neu-mann(1980)详细地讨论了植物悬浮培养技术。甘蔗悬浮培养程序如下：
1．选择易碎愈伤组织培养，通常在第5-7次转移时进行。
2．将愈伤组织(约1．0g)接种在250ml欧氏三角瓶中，装30ml液体MS-C(加2，4-D13．6μM和蔗糖37．6mM)。
3．培养体放在旋转振荡器上(120rpm)7天，以利释放单细胞和聚合体。
4．将细胞培养体过滤(网孔直径300μm)。摒弃滤膜上的剩余细胞，收集滤过物。
5．把三次滤过物放在一起，离心100×g5min。
6．收集片状沉积物，培养在装有新制备的MS-C的有侧臂的Nephelo三角瓶中(Manasse，1972)。
7．每隔一天旋动细胞培养体，向侧臂倾斜，10-15min后，读下沉细胞体积高度，以测量细胞培养体的生长。
经适应培养基特点3月后，培养体应由20-50个细胞组成的较小白色聚合体。分散程度是否充分，视甘蔗基因型而定。含大量酚类化合物的栽培品种，常难以启动细胞培养。这种情况下，必须改变培养基成分，以MS-C不加椰乳，加0．29-0．57mM盐酸-L-半胱氨酸为宜。I)ougall(1980)详细讨论了控制植物悬浮培养的建成和发育的因子。
(五)原生质体培养程序
Cocking(1960)提出酶法分离植物原生质体以来，植物原生质体已成为研究无性杂交以及遗传转化和突变体选择的重要手段。Liu建立了适用于甘蔗原生质体分离和培养的体系。
1．甘蔗幼叶为外植体 用茎尖最内层第二叶为供材。切成1mm2片，浸入酶混合液，放在往复振荡器上(120rpm)，32℃。间隔1h，取出少量叶-酶混合样品，用血球细胞计数器计数原生质体。酶混合液Onozuka∶Macerozyme为4：3溶于0．7M甘露糖醇，培养2h后，原生质体产量最高(22×10／g鲜重)。约7%新分离的原生质体有一核以上，可能是自发融合结果。培养24h后，可见新细胞壁合成。如用悬滴培养法，2-5天内原生质体进行第一次细胞分裂。培养3周后，形成细胞团。
2．甘蔗悬浮培养物制取原生质体 原生质体分离从甘蔗cv．F164悬浮培养物收集1ml2-5日龄细胞，与10ml过滤消毒酶溶液——4．0%纤维素酶OnozukaR10，1．0%glusulase，0．35MD-甘露糖醇，0．35M山梨糖醇，5mMCaCl2·2H2O和1mMCa(H2PO4)2·H2O混合。将细胞-酶混合物培养在旋转振荡器上(100rpm)，约28℃。培养2-3h后，约有27%细胞转变成原生质体。处理时间短于1h长过4h，降低原生质体产生量。细胞培养体生长时期，是最适释放原生质体的关键。通常，稳定生长时期细胞不会释放原生质体。酶溶液pH也会影响原生质体释放率。pH愈低，原生质产量愈高；pH4．0最适。释放后，用P6培养基洗原生质体3次，用低速离心法(90×g，5min)。P6培养基成分是：MS盐类，0．3MD-甘露糖醇，0．3M D-葡萄糖，58．4mM蔗糖，80．3mMCaCl2·2H2O，5mM L-谷氨酰胺，0．5mM Ca(H2PO4)2·H2O，3μM盐酸硫胺素，0．5mM肌醇，13．6μM2，4-D，5．4μM NAA，4．4μM BA和10%(v／v)椰乳。
3．采用细胞饲喂技术 采用Chen(1978)法将cv．F164纯净细胞植板在6-cm培养皿中成一薄层。30℃培养7-14天后，形成许多小细胞无性系。将聚酯单层膜织物网孔10μm放在细胞层上，然后散布其上3m1琼脂P1培养基。P1培养基是P6培养基不加73．5mM CaCl2·2H2O。用石蜡膜封边，培养在26℃10-15天。用洗过的原生质体0．2ml(约105细胞／ml)层布在培养基表面上，培养在26℃。常规检查原生质体生长。培养后3天，大多数原生质体增大2-3倍。有些出芽或暴破。5天后，生存的原生质体再生细胞壁，并进行第一次细胞分裂。第10天近乎10%分裂成4-6个细胞团。加几滴渗透压降低的P6液体培养基，细胞团生长加强。25天后，细胞团发育成0．1-1．0mm克隆。再培养10天后，然后把它分离和培养在MS-C上，分离的细胞团很快长成愈伤组织。至今，原生质体产生的愈伤组织还未见再生植株。
(六)展望
植物组织培养已为植物育种者利用了20年以上。对甘蔗改良言，某些技术的进展不大，如分离的原生质体的融合，以取得体细胞杂交，通过基因DNA交换达到遗传转化，花药或花粉培养产生单倍体植株，建立同质系。但甘蔗组织培养者在下列领域处于领先地位：(a)培养的细胞和再生植株中发生遗传变异性研究，(b)充分发掘遗传变异性取得抗病性，高产和高蔗糖体细胞克隆用于商品生产，(c)测验了愈伤组织块的器官建成和胚胎发生。
就植物育种家的展望言，产生农业有用变异体对甘蔗改良已有些效果。目的在于利用愈伤组织细胞的能力，在培养中进行遗传改变，特别是只要改变少数农艺特性。可是，这些遗传改变是非定向的。因此，甘蔗组织培养家，在能保持高产能力下，筛选一、二个性状改进的品种，遇到了常规植物育种家所面临的同样困难。为了提高选择的成功频率，必须增大愈伤组织产生的植株群体到足够数量，以及必须开发更有效的技术，用于检测改变的农艺特性。
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