甜菜
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第687页（11507字）
甜菜〔Beta vulgaris L．var．saccharifera(Atissima)〕属藜科BetaL．属。
采属(Beta L．)有15种，分三节：Vulgaris Transch；Pattellaris Transch和Corollinae Transch。有些经济上重要种属Vulgaris Transch，包括B．vulgaris L．var．cicla(饲用甜菜)；B．vulgaris L．var．Esculenta(根用甜菜)；B．vulgaris L．var．crassa(根用饲料甜菜)和B．vulgaris var．saccharifera(Altissima)(商品甜菜)。甜菜是根用甜菜与叶用甜菜的天然异种杂交产生。Beta属基础染色体数是9。不同种包括进化远的种染色体大小和形状很不同。全部栽培种是二倍体(2n=18)。天然多倍体有：B．patellaris Moq．(2n=18或36)；B．lomatogona F．et．M．(2n=18或36)；B．corollifora Zoss(2n=36)；和B．trygina W．et K．(2n=54)。
(一)研究进展
初期研究发现甜菜非组织化愈伤组织全能性很小，由于这种限制大多数研究用于克隆微繁殖。
1．微繁殖 甜菜微繁殖结果综合列如表26-3。
表28-3 甜菜微繁殖取得结果综述
甜菜微繁殖能用叶柄和叶直接再生不定芽来完成，还有幼苗茎尖形成腋芽和不定芽，侧花芽、花球、花序近尖部分等。芽繁殖和继之根发育视启动外植体源和供体基因型而定。许多学者用幼苗茎切段，花芽，花序顶尖部分取得再生。其优点在于它们的遗传稳定性和形态建成潜力较其它组织为强。不同实验室采用的培养基不同，加BA0．5-50μM常见芽形成。繁殖率5-10至45-50芽，视供试基因型而有不同。芽生长旺盛。单胚纯系连续继代在BA培养基上产生玻璃状芽，这是严重问题。缩短BA处理时间或用2ip或ZEA代替BA似可防止芽畸形。
2．愈伤组织和悬浮培养基的器官发生和胚胎发生 甜菜根、幼苗组织、幼叶、叶柄、花梗、花球、花序和胚都曾启动愈伤组织。深入研究初生愈伤组织提出关于外源生长物质功能无从概括。能在加各种生长素和细胞分裂素组合和浓度的各种培养基上均能启动。继代愈伤组织生长可反映出生长调节剂的差异。这种愈伤组织培养体能产生再生(表26-4)。迄今只有五个工作组成功地分离出高频率再生的长期愈伤组织系。De Greef与Jacob的细胞系，器官发生保持在无荷尔蒙培养基上，其他4组则有赖于特定植物荷尔蒙成分和含量。Saunders(1982)和Barocka(私人通讯)指出只有加细胞分裂培养基上形成芽。可是，甜菜愈伤组织的器官新形成，可能为非典型物质2，4-二硝基苯酚(一种氧化磷酸化非偶联剂)或低温处理(5℃)花球所加强，系202-2n培养在PGoB+0．6μM GA，10μM NAA十4．6μMK IN90-100天，继而转移到芽形成培养基：PGoB+0．15μM GA，10μM NAA+4．6μM KIN。至今在这种培养基上观察到愈伤组织和芽形成二者。
表26-4 甜菜愈伤组织继代培养体再生植株结果综合
从一个细胞无性系产生的细胞悬浮连续培养物，能以产生胚和胚状结构，用代谢产物和核酸的抗代谢产物和蛋白质代谢连续处理的话。
特定基因型的形态建成表达，是内生和外源生长调节物质和诸营养组成间的平衡和互作，通过各种物理因素的累积效应的结果。详细研究了生物素含量，它在需和不需生长素愈伤组织内代谢；2，4-D作为保护者的效应；钙、麦角甾醇、麦角钙化醇和胆钙化醇对作为IAA氧化酶的过氧化物酶活性的作用。
器官发生和未器官发生的甜菜愈伤组织的比较，指出前者含较高水平过氧化物酶活性．和较多过氧化物酶同工酶。也发现含有较高水平过氧化酶抑制剂和生长素保护剂(生长素氧化酶抑制剂)。IAAGC-MS分析指出其荷尔蒙水平较低。这可能导致达到一种生长素-细胞分裂素比率，适合于诱导芽形成。可以预料内生生长素-细胞分裂素比率，能因其它外界因素而改变，如低温，可能决定形态发生效果。
可得出结论，甜菜愈伤组织培养物的再生，基本上依赖于基因型、外植体源、内生荷尔蒙水平和低温处理。
3．单倍体植株产生 曾用几种方法测验甜菜单倍体的诱导：(1)天然多胚性；(2)授粉前辐照花粉；(3)B．vulgaris二倍体与四倍体杂交，或野生种(B．patellaris，B．．procunibens，B．webbiana)与B．vulgaris杂交；(4)花药培养；(5)人工培养未授粉胚珠。以研究突变诱导和检测和产生同质二倍体供育种利用。
甜菜花药培养仅取得愈伤组织和根，而无芽。看到原胚，尤以四倍体系110号如此。但是这些原胚在培养25天后停止发育。有些胚形成非组织愈伤组织，偶见芽，染色体数18-36。可能供体基因型对甜菜雄核发生有关键作用，由于有许多隐性基因存在，在单倍体水平上产生有害效应。最近Rogozinska与Goska(未发表)研究不同细胞分裂表(1μM-ZEA，2ip和BA，LS+5μM NAA)对甜菜花药培养的影响，产生了苗，效果以2iP>ZEA>BA。
Hosmans等(1983)用未授粉胚培养在7327个中产生155植株。其中17(10．9%)再生成植株。观察4株营养繁殖植株的染色体和叶绿体，证明是雌性材料单倍体水平。Kiemer等(1984)报道了同样结果。用细胞质雄不育为供体，以保证未去雄未受精胚珠。25个诱导产生的胚发育成芽。取得多数二倍体和极少单倍体。尚须研究大规模产生单倍体的花药或胚珠培养的有效技术的基础理论，以提高其频率。
4．原生质体培养 甜菜分离叶原生质体已获成功。但细胞分裂频率很低。Smolenskaya等(1981)和Szabados等(1983)用甜菜细胞培养体开发原生质体分离和形成细胞团的可复现技术成功。二者都用生长快的悬浮培养物。条件的培养基培养3日龄细胞悬浮体，观察到这种条件对原生质细胞团形成高频率(高达35%)有强烈影响。
5．离体培养遗传稳定性 遗传不稳定性是植物细胞培养最常见现象。甜菜愈伤组织培养也非例外。变异性程度依赖于供外植体源，和人工培养技术。茎尖启动和繁殖的全部植株是细胞学和表型稳定。但是当用叶柄无性繁殖时，能观察到再生植株中的倍数性水平与供体的稍有差异。
甜菜愈伤组织的变异性是一种典型现象。初生愈伤组织启动后，立即能测出多倍体性和非整倍体性。可以设想长期培养物表现的器官发生能力消失和自养生长与染色体数变异增加有关。
6．模式体系研究 甜菜组织培养体是研究生长、转移和糖积累、酶活性和不同次生产物如甜菜碱(Constabal 1969)的好模式体系。Smith等(1981)研究过NaCl对整株生长和相应的愈伤组织培养物生长影响。
(二)培养程序
1．无性繁殖和次生茅形成
(1)植株材料消毒 种子须去壳。任何植株部分可用下法消毒：(1)仔细洗；(2)浸入70%乙醇20s到1min；(3)浸入．2-10%(w／v)次氯酸钙或钠(Clorox)过滤溶液10-45min，无菌蒸馏水洗3次。曾用0．1%HgCl2溶液或溴水1-2%(w／v)。Powling等(1980)曾用0．04%HgCl2消毒20min到1h。配合应用抗生素75μM氯霉素，40μM青霉素G．(钾盐)和15μM硫酸琏霉素或tryptone5g／l，YE3g／l，氯化钙1．3g／l加1%琼脂，有利于选择未受细菌污染的芽。
(2)培养条件 非组织愈伤组织应暗培以取得最适生长。产生初生或次生器官发生培养物应保持在光强约1000-3000lx每天14-16h。
温度对离体组织生长影响，最常用最适温度20-25℃。
(3)营养需要 最常用培养基是MS，B5和PGoB。离体培养无性繁殖用培养基：幼苗茎尖和花芽，花序尖，叶柄和叶见表26-5。
芽次生分化难以成功，De Greef等(1979)的方法是从愈伤组织产生芽的好样子。
根形成用培养基与芽形成的相同，所用生长调节剂不同。最常用BA，IBA5-25μM(表26-5)。Slavova等(1983)发现生根培养基加0．15-0．18M蔗糖生根百分最高。
表23-5 甜菜无性繁殖和次生芽形成的培养基(浓度以μM表示)
(4)移栽入土 步骤如下：用温水洗去琼脂，种入泥炭∶沙1∶1混合物中，放入生长箱或生长室(25℃相对湿度约90%，光周期16h，荧光灯1500-3000lx)．2周后，再生植株可供移栽。
2．关键变值
(1)无菌问题 难题在于消除内部细菌污染。
(2)适用的启动外植体 幼苗茎尖、叶柄、叶、花序尖、花球、同株上的芽都可提供分生组织供迅速增殖。
(3)玻璃化问题 会发生玻璃化的基因型，应取大量材料供选择强健芽供繁殖。可用其它种有效的物质予以克服。
(4)再生植株遗传稳定性 大量产生一致性植株供育种利用和杂种种子生产，有赖于遗传一致性的繁殖体。甜菜幼苗茎尖常能产生遗传稳定植株。其它组织培养再生，必须经细胞学和表型鉴定，选择表现亲本特性的再生体繁殖。
(5)生长箱和温室 这是离体培养繁殖关键设施。
(6)经济价值
①最后产物将如何：育种选系，品种测验和培育的亲本系，或商品F1杂种种子生产的材料?
②繁殖率如何?
③繁殖和生根培养基价格?劳力费用?
④移栽土壤物质成本?
⑤移栽用什么机械?
(三)展望
1．微繁殖在甜菜改良的应用 按照Murashige(1978)提出的细胞培养潜在应用有八点：
(1)具有突出遗传性状的植株可以建立无性系。采用离体培养繁殖可保存甜菜组织、细胞、和原生质体培养产生的有价值再生植株。双单倍体、体细胞克隆变异体、体细胞杂种、胚植株，再生植株，抗病植株等等可供育种方案利用。单倍体、白化和叶绿素缺失突变体、带有营养突变的和显性突变植株是人工培养下遗传操作的好材料。
(2)开发遗传一致性植株，可改进甜菜生理、生化和植病研究方法。例如幼苗和成株反应的相关。开展微繁殖研究，可取幼苗茎尖用于产生成年植株的克隆。余下的幼苗部分的反应，可用于评价基因反应，于是，茎尖产生的成年植株能用于田间评价。
(3)微繁殖可为操作个别植株基因型提供机会。详述如下。
①二倍体化和多倍体化：从单倍体和二倍体植株很快取得同质双单倍体和四倍体系尤为重要。
②采用离体培养繁殖甜菜，以取得体细胞减数(非整倍体、三体、单体、缺体，甚至单倍体)，方法是Co60或X射线辐照植物材料，和应用培养基中的选择因素。Atanassov(未发表)用5KradCo60辐照，培养在基础培养基盐类浓度加5倍的培养基上再生，已取得表型变异、染色体数2n=18的甜菜植株。
③甜菜外植体产生不定芽。Broertjes等(1978)指出马铃薯、菊和其它种用诱变剂处理后，作为诱导突变之源。在那些分生组织中，可避免野生型和突变细胞间的竞争。预备试验指出这种方法能用以取得高频率抗1mM 2，4-D，Cercospora beticola(40%)培养过滤物和高浓度蔗糖(74mM)的植株。这种技术能产生嵌合组织的分离。
④叶柄和其它体细胞外植体开发遗传变异性，以助产生有价值再生植株。例如雄性不育恢复可育型成功率比热处理分生组织培养体更高。
⑤病株处理 已证实甜菜分生组织培养体能耐受热处理(36℃)生存9周。可用以消除病毒或其它病原菌。病毒病根茎是一例。
(4)微繁殖技术对甜菜杂种种子生产很适用，可用以亲本系和支持系，尤其它是二年生作物。基于二倍体、三倍体和四倍体水平的杂种优势育种，保持甜菜亲本型有若干问题，需要若干品系。甜菜具有自交不亲和体系，种子发芽率低，和需要保持雄不育性。此外，还有若干其它亲本系能以克隆，包括雄性不育恢复系或保持系(它们要求连续自交)，不同倍数性(4n，5n，6n，8n)的多倍体系，优良基因型和异质基因型。需要的基因型繁殖成功，可简化这种复杂育种事业，避免遗传保持和种子传播等复杂性。
(5)微繁殖是培育甜菜优越杂种型的有效和快速方法。这样能大规模产生杂种种子和材料，具有遗传差异性，不受亲本杂合性或纯合性限制。一个亲本系迅速建立无性系，可供植物育种家选择任何出现需要的遗传特性个体植株作为亲本。应能取得发芽率95%，单种核的、抗病、不抽苔、高产和高糖含量的杂种种子。这可用有性杂交和原来植株的微繁殖相配合，以提供本源杂交的大规模重复。有性杂交的大田测验和评价容许选择旺势杂种，用离体培养其亲本。陶汰其它亲本和杂种。由此大规模繁殖亲本植株，能产生遗传上与原来杂交相当的杂种种子。理论上，这类杂种可在4-5年内取得，而不要经8-10年以培育和产生新杂种。
微繁殖技术提供着种质保存机会。把甜菜培养在琼脂营养培养基上，4℃，低光强下可保存许多月和年。由此为育种目的和品种生产保持亲本系提供简易、费用低，无病系统。
为甜菜改良进一步发展细胞培养技术。
甜菜微繁殖较快，每年11200-250000；而常规繁殖只有1：5-500细胞培养也能产生优质、一致性植株。这些技术虽有许多优点，但尚待开发。
(6)形成多倍体 甜菜杂种优势表达需有四倍体。Hessey等(1978)和Slavova用秋水仙素0．3%处理人工培养繁殖的二倍体芽取得四倍体。由于形成了许多嵌合体，可见这些芽并非来自单细胞。
甜菜细胞质雄性不育恢复雄育性，细胞质雄性不育(CMS)受一个细胞质因子和至少二个核基因互作控制。指出细胞质因子可能是类病毒颗粒，能以导致“雄不育”反应。采用热处理(36℃和以上)继之分生组织培养，有可能从CMS植株取得雄可育植株(Lichter1978)。这些结果支持着这种假说，这种新雄性可育性，依赖于含RNA颗粒的减少或消除。可是，尚待研究以阐明是否每种CMS植株都能产生雄可育伙伴，这些可育株是否适用作保持系。
不同倍数性水平的单个基因型微繁殖。在短期内能产生大量克隆材料n，2n，3n，4n，5n和6n，并用于育种方案。当用叶柄时，应注意有少数芽(2%)将产生不同于亲本的启动倍数性水平。
(7)诱导春化和开花 用幼株能完成甜菜春化作用。当用低温5℃暗处理人工培养繁殖的试管苗70天，栽在温室内3月后能产生茎秆。采用试管苗春化可省地、省功、省能。
Saunders(1982)在无低温条件下，用白炽光处理70基因型，32-75天，250小枝抽薹。但未列出正常雄性或雌性可育性论据。
(8)低温贮藏 人工培养再生植株低温储藏是保存选出的基因型适宜方式，需时1-2年。采用此法有利于不同年份优系间的杂交。Atanassov(未发表)把芽培养在繁殖培养基上，蔗糖增加到10%，5℃贮存2年后，有70%芽生存。Keiner(1984)用无荷尔蒙培养基加10g／l活性炭取得相似结果。
2．扩大应用于其它作物 甜菜微繁殖技术可扩大应用于种子繁殖种，如甘蓝、洋葱、胡萝卜、向日葵、番茄和紫苜蓿。其它离体培养技术如组织、细胞，原生质体培养体中的次生形态建成和胚胎发生，为遗传研究和育种改良提供更大可能性。
其它人工培养技术应用于甜菜遗传学和育种研究，尚须大力开发和改进方法，能从愈伤组织，细胞悬浮物，原生质体，花药和胚珠培养物取得常数芽再生。这类方法可为细胞遗传操作提供许多可能性。体细胞杂交、染色体和基因转移研究很需要遗传变异性。单倍体是研究和育种的关键。高频率同步体细胞胚胎发生将为开发液播即人造种子体系提供最好机会。
近5年来建立了许多甜菜组织培养研究工作组。显然这种新生物技术与常规方法相整合，将对农业改良作出重要贡献。
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