咖啡
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第694页（19945字）
咖啡是国际市场最重要农产品之一。咖啡(Coffea arabica L．)和C．conephora是广泛的栽培种。高产和植株长势育种曾取得成功。单株选种是最常用方法。曾用回交方法把其它栽培品种或种的特性转给咖啡，如短节间或抗病、虫性。叶锈病Hemileia vastatrix和浆果病Colletotrichum coffeanum为害最严重。新技术应用尚待开发。
(一)研究进展
Staritsky(1970)开创咖啡组织培养，用C．canephora主轴芽成功地诱导产生了体细胞胚和再生植株。Colonna(1972)建成了C．canephora和C．dewevrei胚培养体。Keller等(1972)诱导咖啡胚乳组织产生愈伤组织，研究咖啡因合成。Sharp等(1973)培养咖啡体细胞和单倍体组织取得愈伤组织生长(叶柄，叶、绿果)，原胚(花药)和芽发育(主轴芽)。Manaco等(1977)用咖啡和C．stenophylla外胚乳组织诱导大量松散愈伤组织。不加生长素外胚乳增殖很快，认为它是生长素自养的。Townsley(1974)为了从悬浮培养体生产咖啡芳香剂，从C．arabica cv．El Salvador主轴芽产生的松散愈伤组织，建成咖啡细胞液体培养体。并用于分析咖啡咽和氯原酸含量和比较绿豆与细胞悬浮体的非皂化脂质。曾培养咖啡属的数个种，只有大咖啡取得了快速和松散愈伤组织。Herman等(1975)报道咖啡叶外植体取得类器官，7个月后带根再生植株移入土中。Frishchknecht等(1977)固体培养的咖啡品种Bourbon Vermelho茎外植体，分析生产咖啡咽和其商业应用的可能性。Sondahl等(1977，1979)描述了成熟叶培养诱导产生的体细胞胚高和低频率的差别。组织学研究证实了其体细胞胚是从叶肉细胞产生的。培养70天出现低频率体细胞胚(LFSE)，而只有二次继代的90-120天才测得高频率体细胞胚(HFSE)。后者产生于特定细胞表型(小圆形直径约150μm)，而愈伤组织细胞是长棒形，直径约150μm。C．canephora，C．congensis，C．dewevrei cv．Excelsa和咖啡品种Mundo Novo，Catuai，Laurina和Purpurascens也高频率产生体细胞胚。
咖啡品种Bourbon叶愈伤组织分离的原生质体，和约有30%培养体取得愈伤组织产生的原生质体。Orozco等(1982)观察到幼叶分离的原生质体咖啡小克隆。这些培养体第一次继代在半固体培养基上未获成功。Nassuth等(1980)描述了C．canephora茎外植体的愈伤组织和胚形成早期的组织发生。观察到愈伤组织产生于皮质薄壁细胞。培养14天后，在愈伤组织带内出现类胚结构与咖啡叶培养物的LFSE相似，Arabusta(C．arabica×C．canephora4xF1杂种)叶外植体产生的体细胞胚，出现于富含细胞分裂素和无生长素培养基上培养90天后。C．canephora卵细胞(受精后35天)初级培养90天后也取得体细胞胚。咖啡节外植体培养物，从叶轴的休止芽发育成2．2再生植株。咖啡品种Mundo Novo和二个异种杂种(C．canephora×C．eugenioides；C．cangensis×C．eugenioides)培养120天后每节产生4．5植株。Arab-usta休止芽作为营养繁殖也取得了芽发育。咖啡顶尖分生组织培养，目的在于种质保存。
总之，咖啡属的5种和咖啡5个栽培品种的主轴芽和成熟叶固体培养物取得再生植株成功。常见直接(LFSE)和间接(HFSE)体细胞胚胎发生。曾观察到休止主轴芽和顶尖分生组织的芽发育。最后，观察到游离原生质体的愈伤组织增殖。
1．叶培养 温室植株的主轴和侧枝上取成熟叶，放入1．6%次氯酸钠(30%商品漂白粉)表面消毒30min，无菌双蒸馏水淋洗3次。大田植株表面消毒要困难得多，可采用：2．6%次氯酸钠30min，无菌水淋洗，放入封边的培养皿内。过夜，再用2．6%次氯酸钠30min，无菌水淋洗3次。70%乙醇和HgCl2溶液对咖啡叶有毒，次氯酸钠或钙有效无毒。把叶浸入消毒溶液前，用1%去垢剂手洗，蒸馏水淋洗。如果有臭氧水，可用以浸叶3min。抗生素和流行杀菌剂加入盐-糖培养基预处理3天，有利于降低细菌和真菌污染。
叶切成约7mm2，除去中脉，叶边，和叶身的顶端和叶茎。四边都要切，由于愈伤组织常在切边发生。组织学研究证实了叶肉细胞也能产生愈伤组织。
叶切片放入20×100mm培养皿，装有1／2MS+0．06M蔗糖培养基。叶预培养可在暗或光下进行约72小时。预培养对选择生活的外植体和消除叶小片污染很有用。叶背向上。培养并用50ml方瓶，装10ml高压蒸气消毒的基础培养基，MS无机盐类，30μM盐酸硫胺素，210μML-半胱氨酸，550ml肌醇，117μM蔗糖，和8g／l琼脂。初次培养，诱导培养基加KIN(20μM)和2，4-D(5μM)。暗培，25±1℃，45-50天。对咖啡品种Bourbon是理想诱导培养基。
二次培养体放在光周期12h，24-28℃，用50日龄愈伤组织继代在“条件性培养基”上，含有1／2MS无机盐类(除KNO3加倍)，蔗糖58．4μM，KIN2．5μM和NAA0．5μM。转入条件性培养基后，成团薄壁细胞型愈伤组织停止，组织缓慢地转褐。咖啡叶外植体的二次培养体，鉴别出形态分化有二种顺序：LFSE或直接胚胎发生和HFSE或间接胚胎发生。按照咖啡品种Bourbon的标准培养程序二次培养13-15周后出现LFSE，16-19周后出现HFSE。在5000以上培养物中，LFSE比HFSE早出现3-6周。
游离体细胞胚发育成正常绿色再生植株，典型LFSE每培养物1-10株。HFSE的突出发育顺序：带有球形结构的白色松散愈伤组织，从非增殖中的棕色愈伤组织细胞发育产生，叶胚性发生组织；球形结构同步发育4-6周，胚性发生组织产生体细胞胚，最后再生植株，但后期发育同步性差。每簇胚性发生组织平均产生100体细胞胚，虽有差异。分离胚性发生组织，光培，26℃，5-10ml基础培养液不加生长调节剂4-6周，发育加速，充分发育的再生植株百分数增高。此后，可把鱼雷形体细胞胚和幼再生植株植板在盐-糖培养基上，加0．015-0．03M蔗糖，光培。带有发育良好主根的各别再生植株，洗去琼脂，立即移入小钵中，放在保湿箱内。经一个月锻炼后，可放入正常大气湿度中，移置温室。再生植株锻炼另一方法，用250ml欧氏三角瓶装100ml盐-糖培养基不加蔗糖，用棉塞封口。放在温室蔗荫区的日光下。常用塑料薄膜，透光约60-70%。约经2个月后，植株叶和根发育良好，可移入钵土中。
不同种和若干咖啡栽培品种采用了这种程序，取得了若干形态突变体的叶组织产生的体细胞胚，借以评价这种方法的遗传稳定性。取得了下列单基因突变体的分化，Erecta(Er)，Purpurascens(pr)，Angustifolia(ag)，Nanna(na)，San Ramon(Sr)，和Volu-tifolia(vf)。目前这些培养体具有胚性发生组织，和不同发育时期的体细胞胚(表26-6)。这些突变体叶外植体产生的植株的遗传分析，将为利用体细胞胚生产于营养繁殖的可行性提供新见解。再者，将可能深入区分器官和胚胎发生间的遗传稳定性和细胞学的起源。
表26-6 咖啡6个形态突变体的叶培养物和体细胞胚再生
a．包括有胚性发生组织和胚的三角瓶。
采用培养成熟叶相同方法，改变2，4-D浓度，培养3月龄幼苗咖啡品种Mundo Novo的子叶。初次培养(条件性培养基)2月后资料例如表26-7。污染极少，最低量(1μM)也能诱导分化不定根。进一步培养，选用了5μM 2，4-D，与成熟叶培养相同。
表26-7 咖啡Mundo Novo子叶外植体愈伤组织诱导2
a．初次培养基上2个月后
2．下胚轴外植体培养 取3月龄咖啡品种Mundo Novo下胚轴，用成熟叶培养法培养。初次培养2月后，愈伤组织生长情况见表26-8，下胚轴愈伤组织增殖与叶外植体的相似。但是，1μM不能诱导根分化。二次诱导培养基上，观察到胚性发生组织。
表26-8 3月龄咖啡Mundo Novo下胚轴外植体愈伤组织诱导
3．胚培养 取胚前，咖啡种子先表面消毒。Colonna等(1971)用95%乙醇真空下浸lmln，继之0．7%次氯酸溶液5min。种子浸水(无菌蒸馏水)36-48h。用75%商品漂白粉(约3．9%NaOCl)处理30min，放在旋转振荡器上，150rpm连续振荡30min，无菌水淋洗3次。无菌种子培养在盐-蔗糖琼脂板上3-4天。用蒸馏水浸种子，结果不好，由于在液体中发生交叉污染。HgCl2和乙醇对种子有害。剥除果皮，然后消毒。振荡时，可完全消除银皮。另一消毒方法。将种子(无果皮和银皮)浸水12h，取胚，消毒之(1%NaOCl 8min)。未成熟培养期间，把幼果浸入70%乙醇表面消毒3min，继之3．9%NaOCl 30min。蒸馏水淋洗后，在无菌条件下切取未成熟胚。
Heller固体和液体培养基：Heller盐溶液加58．4mM蔗糖，1．1mM肌醇，3．0μM硫胺素，6．5μM半胱氨酸，1．0μM泛酸钙，8．1μM烟酸，7．4μM腺嘌呤，3．9μM吡哆醇和4．0μM甘氨酸。Colonna(1972)曾用于C．canephora cv．Robusta和C．dewevrei cv．Excelsa和Neo-anddiana的成熟胚。必须继代，以供连继发育。液培根生长期长，但琼脂培养基发育更有规律。培养后第45天和75天出现第一对叶，C．dewevri cv．Excelsa于第75天发生第二对叶。培养基加2μMIAA伸长增高17%，10%CW加IAA的，培养第40天，伸长增加38%。培养体保持在12h周期，28℃日，21℃夜。
咖啡Mundo Novo和Catuai成熟胚，培养在1／2B5无机盐类，58．4mM蔗糖，30uM烟酸，30μM硫胺素，55μM肌醇，15μM吡哆醇，1μM BA，0．20μM IAA，和琼脂8g／l，pH5．5，光培，24-28℃。培养后60和90天后观察，指出5-10μM IAA诱导生根极好，但根发育则以0-0．25μM IAA为好。0-0．25μM IAA下胚轴和叶发育好。据此，培养咖啡采用上述培养基加2．5μMIAA，作为初次培养离体胚。由于IAA为IAA氧化酶系统自然降解，暴光下尤盛，随着培养时间增长，IAA浓度会下降。培养50-60天后，培养并可移置高光强下，甚至移放在温室内遮荫处(70一80%遮荫)。采用此程序，培养咖啡×C．canephora杂交未成熟胚取得成功。
4．顶端分生组织培养 Kartha等(1981)从咖啡Caturra Rojo和Catwai无菌幼苗分离0．3mm顶端分生组织。培养基组成：MS盐类，B5维生素，附加BA或ZEA 5-10μM，NAA1μM，诱导多芽，低浓度细胞分裂素产生单芽。1／2MS加1μM IBA不加蔗糖取得生根。
Sondahl等用3月龄C．anabida cv．Mundo Novo取顶端分生组织，植板在盐类-蔗糖琼脂板上。取192分生组织预培养5天后，移入初次培养基(除去污染材料32%和氧化的4%)。培养基为MS盐类(0．1×微量元素溶液)，吡哆醇15μM，烟酸15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，半胱氨酸500μM，蔗糖0．037M，IAA 0．5μM，和各种浓度BA(表26-9)。培养10周后，分生组织培养在5μM BA的生长最旺。生根培养基为1／2MS盐类(0．1×微量元素)，蔗糖0．058M，维生素IBA 5-10μM，和NAA 5-10μM。全都只产生长，单根。为了形成次生根和根毛，再生植株继代在沙∶
石(2∶3)无菌基质中。咖啡Catuai顶端分生组织用cv．Mundo Novo相同程序培养，结果相似。
表26-9 3龄咖啡Mundo Novo幼苗顶端分生组织培养2
a．初次培养60天后
5．腋芽培养 无菌生长的C．anabica植株的节外植体，培养在MS附加BA44μM和IAA 0．6μM，16h光周期，光强2000lx，25±0．5℃。培养2-5周后，平均每节2．2芽。暗培加NAA1．1μM增强芽生根。建议取3月龄人工培养植株的节切段，并在培养期间保留叶。加ME400mg／l和BA4．4μM培养基观察到芽发育。
(1)侧芽 诱导开花前切取休止的侧芽，培养在：MS盐类(0．25x微量元素)，吡哆醇15μM，烟酸15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，半胱氨酸500μM，蔗糖0．087M，IAA 0．5μMBA 25μM，链霉素1g／l和琼脂8g／l。用去垢剂和自来水洗侧枝，放入湿箱内培养48小时。然后取出材料，用50-75%商品漂白粉，表面消毒30min，无菌水淋洗3次。表26-10汇综了咖啡4个栽培品种侧芽培养的结果。初次培养后50-60夫后，侧芽转入二次培养基，诱导继续发育：MS盐类(0．25x微量元素，半胱氨酸500μM，吡哆醇15μM，烟酸15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，活性碳5g／l，蔗糖0．03M和琼脂8g／l)。
表26-10 4个咖啡栽培品种的休止侧芽的发育
(2)主轴芽 供试植株取是10月龄温室，1-2年龄苗圃或15-20年龄大田。切取带有4-6节的绿色主轴芽。用1%去垢剂和无菌水洗后，用2．6%次氯酸钠表面消毒30min，连续振动(150rpm)。苗圃和大田生长植株放入湿室过夜，同法进行二次表面消毒。除去全部主轴芽的顶端分生组织。顶端分生组织下的最上端的节。编号一号。有可能时，这些芽着生叶对，切成原来大小的1／2和1／3。
初次培养基组成：改进的B5加吡哆醇15μM，烟酸30μM，肌醇550μM，半胱氨酸500μM，蔗糖2．5g／l，pvp-40 1g／l，和琼脂7g／l。培养瓶容积150ml，装25ml培养基。接种单节的培养瓶，用16．5μMpvp-40封口。这种膜的渗透性：CO2每24h10cm3／cm2，氧每24h 2cm3／cm2；氮每24h0．4cm3／cm2和水蒸气每24h10mg／cm2。
节培养保持在生长室中，光强400lx，光周期14h。824节外植体(取自大田生长的4个栽培品种)平均污染率43%，氧化率42%(表26-11)。
表26-11 初次培养30-60天后选择的大田生长咖啡植株的节培养物
a．Catimor和Timor杂种节培养物结果相似
培养3周期间，可见节培养体中的休止主轴芽的发育。每节发育的芽1-6，受细胞分裂水平的部分控制。较高水平诱导效果较好，但对继续生长不利，生根频率降低。BA(25μM)比KIN更有效(芽／节2。1比1．2)，50μM时为2．3∶1．4。
测验了GA对芽节间伸长的影响。在切取生根时，用25-50ppmGA直接处理发育中的芽有效。
当芽长到三节(培养后约60天)可切取备生根用。加IBA10μM的生根频率为60%。生根可用双层培养基，上层用基础培养基加IBA10μM，底层用加活性碳2．5g／l的基础培基。另一生根技术，用生长素处理未发育的芽10天，转入固体培养基，或滤纸桥上。用滑石制备的生长素处理的芽，在固体培养基上，生根频率高(60%)。
切取最初发育的芽后，将节外植体转入新鲜初次培养基，以使剩余的休止主轴芽发育。一个节外植体可生存2-3次转移，由此可使大部分休止芽发育。第三次转移(每二个月一次，6个月连续培养)可得9-10发育中的芽。从原始节培养体产生芽叫初次芽，由初次芽产生的叫二次芽。
按照上法6个月连续培养C．anabida cv．Mundo Novo一年生咖啡株节培养结果(表26-12)。培养最初60天，芽／节频率为1．33。第二次末(120天)累计数为4．5，第三次末(180天)累计数为7．5。
结果证明采用节培养技术，指出了休止主轴芽的营养繁殖潜力。可用于优良咖啡树的繁殖。第二次转移(120天)后，记录到19节取得85芽(85%)。理论估计繁殖率为：
(1)最初生长期间(6个月)，从具有6节的一个主轴枝节培养体产生了3节26芽。
(2)第二生长期间(3个月)，3节104芽。
(3)第三生长期间(3个月)，3节415芽。
总之，最后芽繁殖数，视每供试株取主轴枝数而定。应考虑污染和氧化和生根频率所造成的损失。
采用上述程序，取二个不育异种间杂种节培养。C．congensis×C．eugenioides主轴和侧枝节间切段的切面直接分化体细胞胚。是从皮层产生的，初次培养基上培养44天后，每切段平均产生8体细胞胚。并取得了直接胚胎发生。C．canephora×C．eugenioides节培养体，培养60天后，每节上叶对切端分化大量胚性发生组织。转入条件培养基，完成了体细胞胚发育。这些结果再次强调指出，在相同的生长培养基上，基因型的反应不同。
表26-12 Mundo Novo咖啡节培养的主轴芽发育
a．分生组织下方的最上部芽编号为一
(二)咖啡体细胞胚胎发生的模式
离体培养胚胎发生常伴随着组织化的组织，具有小球形细胞(直径10一20μm)，活跃地分裂(细胞周期短)。菜碱的核，核仁明显，典型的高RNA活性。这种组织在继续细胞分裂而增大，但子细胞的继续发育，变得互相粘合，在分化过程中出现极性。可见球形结构，最后形成心形和鱼雷形期的胚。HFSE的这种组织叫“胚性组织”(ET)。球形结构形成前，有丝分裂活动启动程度，和出现ET的停滞期，视种和外植体源而异。咖啡属叶组织言，这种ET很明显，有完好的特征。应强调ET应追溯到胚性母细胞(EMC)，即在细胞周期的特定调控时期，细胞经特定培养条件启动胚性发生途径。
1．胚胎发生的一般模式 离体培养胚胎发生发展的一般模式，涉及到：(a)直接胚胎发生——不经愈伤组织增殖，直到从组织产生胚(即野生胡萝卜和Ranunculus sceleratus下胚轴的表皮细胞)；(b)间接胚胎发生——愈伤组织增殖和胚性发生组织与胚发育相关连(即栽培胡萝卜的次生韧皮部，咖啡叶组织、水稻花粉和某些其它禾本科作物等等)。直接胚胎发生从先胚性发生决定的细胞(PEDC)产生，而间接胚胎发生需要分化细胞的再决定，愈伤组织增殖和诱导胚性发生决定的细胞(IEDC)。
显然，PEDC等待着诱导者物质的合成，或除去抑制性物质，取得有丝分裂活动的恢复和胚性发育。反之，进行IEDC分化的细胞，需要一种有丝分裂物质，能得有丝分裂细胞循环，和／或用特定浓度的生长调节剂处理。在这种进程中，任何一个步骤都可能发生休止。
细胞循环的每一阶段(G1，S，G2和M)，含有特定合成机制，处于调控之下。在某种已知组织体系中，S和M的时间相当恒定，而G1和G2是可变的。有丝分裂循环的主要控制点，位于G1和G2。有丝分裂后，进行增殖或子细胞的命运，发生在这种关键点上。
培养基内特定外源生长调节剂浓度或浓度比值，对开始胚胎发有二种作用。第一，生长调节剂担负着细胞分裂的启动，即细胞从G0(细胞循环中一种特殊的非工作状态)再进入有丝分裂细胞循环，或Van′t Hoff的主要控制点G1和G2。第二，在G1和G2期间，生长调节剂具有直接或间接控制细胞质因子合成的作用。胞质分裂时，发生不等量的有丝分裂，结果产生二个表型不同的子细胞，导致发生不同的发育模式。
应了解细胞分裂进程中，可能影响继后分化：细胞循环中的事项，决定着或限制着继后的细胞分化途径。有规律细胞分裂和出现可见细胞分化标志间，可能有长时间间隔。设想是当细胞分裂时，一个子细胞保留分生组织的，而其它细胞决定性地变成分化的母细胞。
植物组织培养物的多表型群体概念。用于建立初次培养体的外植体，常由一系列表型细胞群体所组成，可用细胞形态学、生化特征和有丝分裂细胞循环时期表示。这些细胞受不同发育效果的影响，由于它们具有不同DNA样板顺序。再者，其中有些细胞群体，在活跃分裂中，而其它在有丝分裂休止期(G0，G1或G2)。
如果期望一种特殊生长调节剂比率将对分离的细胞表型群体产生一致的影响是不现实的，而是可望一种特定生长调节剂比率影响着有丝分裂和、或一种特定细胞表型群体的再决定。因此，提出胚性发生母细胞是能接受一种关键胚性发生-诱导生长调节剂浓度或一种生长调节物质的浓度比率(生长素／细胞分裂素)的细胞群体的后代。这类细胞在离体培养下有丝分裂期间预决定了它们的发育途径，结果分成二个子细胞，其中之一或是胚性母细胞。显然，生长调节剂(尤其是生长素和细胞分裂素)在条件性培养基中(初次培养基)有二种功能：(a)决定胚性母细胞(EMC)和(b)EMC5同步性。自后，这种细胞群体很可能停留在有丝分裂休止状态，直到继代到胚性发生诱导培养基，不加生长素(常用2，4-D)。使EMC解除有丝分裂休止状态，继而胚发育。
目前还不很清楚产生ET的发育顺序。可能是生长调节剂诱导一种特殊细胞群体产生分化，按照下列现象之一：(a)原有外植体产生的独特表型群体的增殖；(b)干扰-或更多控制点和再决定延长一种特定细胞群体的有丝分裂时间；(c)决定和休止细胞循环内细胞特殊群体，中止在G0，G1或G2。
关于细胞循环活性的有关生长调节剂信息很少。激动素可能引起中止在G1／S界面上，也可能影响碳水化合物氧化，抑制糖酵解，继而通过五碳糖shunt途径而增高碳水化合物氧化。激动素促进的活跃细胞分裂的胡萝卜组织比无激动素中生长的氧化消耗率较低。愈伤组织中不同细胞群体的转录和翻译过程，在不同培养基中，它们的细胞循环阶段间隔影响显然不同。生长调节剂加入培养基，或是间接地或非专化地通过控制细胞分裂和细胞年龄而控制形态建成。有意义的是已有报道愈伤组织年龄，培养基不加蔗糖、或γ射线，能促进甜橙‘shamouti’的胚胎发生!有报道增高2，4-D浓度和增高特定细胞悬浮物的平均世代时间有正相关。也发现增高2，4-D浓度(0．5到70μM)有丝分裂时间增长和有丝分裂指数降低。这些结果部分解释为中止或增长G1和G2，和增长前期和中期相对于后期与末期。胡萝卜只有在除去2，4-D后才能发生体细胞胚胎发生，和胚启动阀值是0．1μM 2，4-D。
过氧化物酶活性顶峰，与橙胚珠组织体细胞胚出现相关连。这些组织的同功酶分析指出正极带显然与胚性发生过程相关联。缩短G1和增高过氧化物酶活性与三岔大麦原基发育有关连。
2．咖啡胚胎发生模式 转入诱导培养基后，愈伤组织薄壁细胞团停止生长，组织逐渐褐化。咖啡属叶外植体二次培养物表现出形态发生分化顺序：低频率胚胎发生(LFSE或直接胚胎发生，和高频率胚胎发生(HFSE)。采用咖啡Bourbon标准培养程序，二次培养13-15周产生LFSE，16-19周后产生HFSE。LFSE在可见HFSE簇出现3-6周前发生。其特征为少数隔开的体细胞胚，与大块胚性组织未关连。
初次培养期间，2，4-D与激动素配合，如此有效地启动HFSE事实(高达60%)是惊人的。其它生长素源(IBA和NAA)与激动素配合，诱导HFSE不很有效(10-20%)。但是NAA+KIN诱导LFSE达60%培养瓶。再者，二次培养体的诱导培养基除去2，4-D和降低NAA+KIN浓度，发现是Coffea spp．HFSE体细胞胚所需。2，4-D启动引导HFSE发育顺序的有效性和优越性，尚难解释。2，4-D和NAA诱导产生愈伤组织，外表明显相似。但是，有可能2，4-D诱导着不同细胞群体的分化。2，4-D和NAA诱导咖啡叶组织的体细胞胚胎发生的有效的生理学差异，尚待做更多试验才能加以阐明。
培养期间咖啡愈伤组织发生二种不同细胞群体：一个由长细胞组成，另一个由小球形细胞组成。初次培养期间叶外植体产生由长薄壁状细胞(约140×25μm)组成的乳色软愈伤组织。经50天后，愈伤组织变褐，再观察不到其增殖。
在不加2，4-D诱导培养基上的二次培养16-19周后，显然可见愈伤组织的松散胚性组织的分化。随着增殖，这种松散胚性组织与原有愈伤组织分开，细胞剥落在周围培养基上。在发育早期，胚性组织由活跃分裂的小球形细胞组成。
在增殖期间，所有球形子细胞相互分开。继而，球形细胞产生的子细胞不再分开，保持集聚组织。这种发育的变化．结果产生球形胚，是人工培养咖啡属细胞胚发育的最早组织化结构。最近，在基础培养基加细胞分裂素(不加生长素)培养的咖啡叶外植体，诱导产生的主要是LFSE。对植物生长调节剂敏感性不同，LFSE和HFSE的时间间隔，LFSE分化模式，提出LFSE的母细胞是从特定细胞群体产生的，与担负HFSE的不同。咖啡叶外植体体细胞胚胎发生发育模式如图26-1。
图26-1 咖啡叶外植体体细胞胚胎发生发育模式
A．在2，4-D和KIN存在下，海绵状叶肉细胞再进入细胞循环B．愈伤组织块中至少有二种细胞群体(长、高度液泡化的)和胚性细胞球形、细胞质浓C．直接胚胎发生模式的胚性细胞亚群体(低频率体细胞胚胎发生)，仍在初次培养期间；转入二次培养基发生胚发芽D．二次培养体期间，除去2，4-D，容许第二种细胞亚群体的分化-胚性组织E．亚群体Ⅰ(低频率)和亚群体Ⅱ(高频率)产生的完全分化的体细胞胚。注意由于分化过程，这二类体细胞胚间有约1-2个月的时间差异
3．胚胎发生的调控机理 培养条件尤其是生长调节剂对培养组织不同细胞群体的有丝分裂活性的诱导有重要作用。依赖于细胞群体的特定调节状态，培养条件将能促进不同细胞循环时间和中止。体细胞胚能追溯到胚性母细胞(EMC)，与二个发育顺序相关连：预胚性发生决定细胞(PEDC)和诱导胚性发生决定细胞(IEDC)。环境和培养逆境能有倾向性地影响不同细胞群体，容许调节变迁和循环中细胞的同步性(决定EMCs)。加强特定体系的EMC群体，可进行更深入分析(细胞学和生化水平的)，将增高体细胞胚产量。可以期望标记DNA，将有可能密切控制在EMC决定期间和继后发育期间的细胞活动。在启动阶段期间，PEDC发育顺序应与IEDC的不同，为了了解体细胞胚胎发生的调控，比较研究这二种途径是有益的。
体细胞胚发育模式(图26-2)提出胚性母细胞(EMC)常与PEDC或IEDC相关连。再者，这种模式将能说明器官发生途径的起源，与正常胚性发生途径是有别的。器官发生于胚性组织形成早期，子细胞在细胞团块内保持相互接着，无极性。
图26-2 离体培养植株再生的分化典型离体培养下细胞分裂后四种不同分化途径，以A、B、C、D表示之
途径A．连续细胞分裂形成禽伤组织细胞 途径B．是不等细胞分裂，再决定产生胚性母细胞(EMC-1)和直接胚胎发生 途径C．通过细胞中止而再决定和释放出胚性母细胞(EMC-2)；由于EMC-2连续细胞分裂产生胚性愈伤组织，最后，胚形成(高频率) 途径D．器官建成途径产生芽形成，有些细胞群体，在人工培养下细胞分裂期间变成决定性的注意这种典型设想胚胎发生和器官建成能追溯到单个细胞，它在活体上是预决定性的，或由于人工培养条件变成诱导的。
(三)培养程序
1．咖啡叶组织的体细胞胚胎发生
(1)叶用1．6%次氯酸钠(30%商品漂白粉表面消毒30min。蒸馏水淋洗3次。
(2)避去中脉和边缘，把叶切成7mm2小块。预培养在盐-糖琼脂板上，暗培36-48小时，然后移至培养基上。预培养培养基：1／2MS，硫胺素30μM，半胱氨酸210μM，肌醇550μM，蔗糖87mM和琼脂8g／l。
(3)把叶正常的无菌叶块转入诱导培养基(初次培养)。基础培养基：MS盐类，硫胺素30μM，半胱氨酸210μM，肌醇550μM，蔗糖117mM，和琼脂8g／l。生长调节剂：KIN20μM和2，4-D5μM。暗培7-8周。
(4)把初次培养体转入条件性培养基(二次培茎)；基础培养基1／2MS(除加2xKNO3)，KIN2．5μM，和NAA 0．5μM。光培3-4月。愈伤组织变成棕色。
(5)继代在条件性培养基13-16周后，从愈伤组织表面出现胚性组织(乳白色，松散)。再经3-6周以上，发育成球形胚簇。
(6)本程序适用于间接胚胎发生(HFSE)和直接胚胎发生(LFSE)产生体细胞胚。用改进的基础培养基中的附加成分KIN或BA 10-20μM和2，4-D 0．5μM以LFSE途，径占优势。
(7)用本程序也取得了子叶和下胚轴组织的体细胞胚。
2．胚培养
(1)用70%乙醇表面消毒咖啡果实5-10min，和用3．9%次氯酸钠(75%商品漂白粉)30min，搅动，无菌蒸馏水淋洗3次。种子除去果壳和银皮后，可用同法消毒。
(2)轻割种子尖背面，解剖出胚。
(3)培养基：1／2B5盐类，烟酸30μM，吡哆醇15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，蔗糖58．4mM，BA 1μM，#IAA 2．5μM和琼脂7g／l。
(4)生长条件：低光强500／Wx，光周期16h。
(5)50-60天后，将出现子叶。胚转入新鲜培养基，不加生长调节剂，放入高光强3000lx或80%遮荫处。
3．分生组织顶尖培养
(1)用1%去垢剂溶液洗绿主轴芽，连续搅动150rpm5-10min，无菌水淋洗。
(2)2．5%次氯酸钠表面消毒30min，搅动150rpm，无菌水淋洗3次。从大田取的主轴芽，先放入温室过夜，再二次消毒。无菌幼苗供切取分生组织顶尖用。
(3)小分生组织顶尖(约0．3mm)立即接种在琼脂培养基上。Kartha培养基：MS盐类，B5维生素，BA或ZEA 5-10μM，和NAA 1μM。Sondahl培养基：MS盐类，0．1x微量元素，吡哆醇15μM，烟酸15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，半胱氨酸500μM，蔗糖87mM，BA 5μM，IAA 0．5μM和琼脂8g／l。
(4)生长条件：见胚培养4和5节。
(5)加IBA 10μM生根。
4．节培养
(1)带有4-6绿节的主轴芽的顶端，用1%去垢剂溶液洗，搅动150rpm，无菌水淋洗3次。
(2)表面消毒同分生组织顶尖培养2步。
(3)取带叶对的各个节培养，通常将叶身切半或2／3片，以利培养。
(4)培养基：B5盐类，吡哆醇15μM，烟酸15μM，硫胺素30μM，肌醇550μM，半胱氨酸500μM，蔗糖87mM，活性碳2．5g／l，PVP-40lg／l，BA 25-50μM，IAA 10μM和琼脂7g／l。
(5)生长条件：见胚培养4步。
(6)每隔60天，切取初生芽，将节外植体转入新鲜培养基。
(7)从人工培养发育的芽取得新芽外植体。
(8)生根培养基：(a)双层三角瓶装有上层加基础培养基加IBAl0μM，底层用基础培养基加活性碳2．5g／l；(b)液体基础培养基加IBA 10μM，培养10天，随之培养液体培养基的滤纸桥上；(c)芽切端插入固体培养基加IBA 10μM。
(9)移入生根培养基前，芽浸入(醮)25-50ppmGA处理。
(四)展望
现代咖啡育种规划，取标准育种方法和人工培养技术之长。体细胞无性系变异和配子无性系变异对arabica和robusta咖啡都适用。大规模无性繁殖尤为robusta咖啡所需。
Duhlin(1980)和Sondahl等(1980)咖啡腋芽培养营养繁殖成功。咖啡典型培养体的理论推算，连续培养12个月，每个主轴枝能生长415芽(茎叶)。这项技术适用于繁殖：(a)不育种间杂种(三倍体)；(b)分离中的杂种进行复式大田小区试验和选种；(c)优越母株(多基因特性)的商品生产；(d)快速增殖抗病基因型，以对付叶锈病生理小种的快速演变；和(e)建立大田小区，选择的优株的种子繁殖。
咖啡栽培品种的遗传储备很狭。诱变剂诱变效果差。组织培养体细胞克隆的遗传变异性，可为培育独特遗传变异提供卓越机会，从中选择新育种系。体细胞克隆遗传变异也能从细胞或组织培养的再生植株中取得。再者，由于体细胞克隆变异体是从自发突变(核的或细胞质的)产生，如果诱导优越商品基因型产生培养体，可望在较短时间内选出新品种，供推广用。
C．stenophora(2n=22)对Perileucoptera coffeela免疫。未成熟二倍体种C．steno-phora与栽培咖啡杂交胚取得成活杂种，并有助于继后回交世代中的基因转移。同样，咖啡三级基因库的其它种间杂交，开辟了咖啡遗传改良的新领域。不仅发掘那些种固有的变异性，也为远缘杂交和引入外源细胞质产生的新奇变异的表达提供机会。原生质融合继之再生植株也是克服遗传障碍的有效方法。这种技术将扩展利用远亲改良咖啡的展望。
大孢子或小孢子培养取得单倍体植株，可能用于产生自交亲和种C．canophora的商品杂种。采用具有优越一般配合力的母株小孢子以生产单倍体植株。经染色体加倍后，选择最好配合力的四种同质二倍体克隆间作以生产F1杂种种子，或生产双杂交杂种。F1花药的配子克隆变异，可产生较大变异供选择和育种。
咖啡属四个种和咖啡5个栽培品种的成熟叶培养体再生植株取得成功。Sondahl等(1980)已描述了高频率诱导胚胎发生和产生愈伤组织的原生质体所需培养基。
根据上述结果，人工培养技术主要研究目标，必须着重于建立咖啡适宜的方法：(a)未成熟种间杂种胚培养，(b)原生质体融合和再生，(c)细胞器和染色体转移，(d)人工培养染色体加倍，(e)子房和花药培养产生单倍体和(f)细胞悬浮培养体，突变体选择和植株再生。这些改进的技术与常规育种方法相整合，以保证新的改良咖啡品种的推广应用。
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