胡椒
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第709页（9329字）
胡椒属茄科辣椒属(Capsicum)，是草本一年生，无限生长类型。育种目标是果形、增强和降低辛辣味，抗各种病毒病，早产，移植后100天内第一次收获。胡椒营养价值高，是维生素尤其C和A的好来源。能鲜食或为香料加工工业原料。是遗传研究的典型试材。
(一)研究进展
Gunay和Rao(1978)首次报道二个一年生辣椒品种和木本辣椒一个杂种品种外植体培养再生成功。MS加各种组合和浓度的生长素和细胞分裂素，研究了一年生辣椒品种Calwon-der和Pimento以及木本辣椒杂种Bharath子叶和下胚轴形态建成。
分析生长素效应，他们发现培养基加IAA或NAA形成愈伤组织和根。NAA诱导产的根短粗，IAA启动的长而细。2，4-D只产生松散愈伤组织未生根。
测验了许多细胞分裂素包括BA，ZEA，KIN，ADE和SD8339对形态建成影响。KIN，ADE和SD8339对诱导分化无效，但产生愈伤组织。ZEA只能诱导杂种Bharath子叶形成茎芽。不同浓度BA能诱导全部兰种基因型的子叶和杂种下胚轴形成茎芽。
Fari等(1981)用一年生辣椒T．Hatvani3周龄幼苗下胚轴切段培养在MS加8．8μMBA和5．7μM IAA，只有尖端产生芽中段生根，基段长愈伤组织。把芽培养在加生长素培养基上生根后，长成植株。
Agrawal等(1983)从C．annuum L．var．mathania培养的胚取得再生芽。采用荷尔蒙的许多类型和组合，每种诱导效应不同。KIN和IAA(0．57μM)使子叶增大，而2，4-D(2．3-4．5μM)加或不加KIN(2．3μM)产生活跃生长的愈伤组织，盖满了整个胚。高水平IAA加KIN形成根。当把胚培养在22．0μM BA上，沿着子叶进缘上形成大量茎芽。但继代在BA培养基上不进一步分化。在含0．54μM NAA培养基上形成了完整植株和植株生根。
Saxena等(1981)是取得胡椒分离的原生质体和再生植株的唯一报道。他们用无菌芽培养的C．annuum var．calwonder叶肉组织，测定了原生质体产量有赖于培养体生长条件。最关键条件是光强，由于低于或高于最适光强3001x，结果使产量降低。
从15日龄叶放入MS溶液，cellulase，macerozyme和甘露糖醇分离出原生质体，培养在NT加2，4-D，NAA，BA，蔗糖和甘露糖醇。24小时内取得细胞壁再生，4-7天后约5%分裂。6周内，从培养在甘露糖醇降低的培养基上的微小细胞簇取得的愈伤组织团块，转移到MS加IAA与KIN时再生了芽。芽生了根，保持在降低IAA与KIN水平的培养基上。人工培养的5月龄植株在长日条件下诱导了开花。Agrawal等(1983)明显地指出芽是从外植体组织直接产生的，不是从愈伤组织来的。
Dix与Street(1975)在不同浓度氯化钠(0．7，1．0，2．0，3．0%)选择压下培养细胞，除3%外，选出了能生存于其它浓度的克隆，经在无盐条件下转移三次，继而移回加NaCl培养基，证实了它们能在选择压下生存。
Dix与Street(1976)分离出抗寒性加强的细胞培养体。细胞培养在琼脂固化培养基上，5℃暗培21天。有些制品用各种浓度EMS处理后培养。经初次选择后，再经5℃培养21天，分离出能生存的若干克隆。用0．75%EMS处理的细胞产生大量生存的克隆(与其它所有处理相比较)，事实上，在继后选择期间，只有从处理的细胞产生的系表现显着抗寒水平。
采用游离线粒体测定氧的吸收分析呼吸作用，以抗寒与非抗寒细胞系相比较。结果指出抗寒系5-20℃表现直线反应，而敏感系以10℃以下有急转入更倾斜波，指出它具有较高活化能。
Dix与Street(1975，1976)研究结果指出通过细胞培养可取得胡椒变异体。抗性系虽能在选择因素不存在时保持这种特性，这种变异不是遗传的，由于这种再生植株的子代分析未能完成。Dix(1977)指出这种变异不是突变，由子用胡椒抗寒性选择同样方法选出的林烟草细胞系再生植株亲本后代，未能观察到抗寒植株。
植物细胞培养的一个有希望领域是通过人工培养技术产生单倍体植株供辣椒属遗传研究用。自Guha与Maheshwari(1964)用南洋金花小孢子产生单倍体胚以来，据已有报道有60属的171种取得了单倍体。
Wang等(1973)用一年生辣椒和Novak(1974)用木本辣椒首次报道辣椒属产生单倍体。Georg等(1973)报道单倍体频率为0．001%，需加IAA以启动培养的小孢子分裂。Sibi等(1979)研究一年生辣椒花药培养，指出单核期小孢子(第一次花粉有丝分裂直前)是培养最适时期，同时用4℃预处理离体花芽。花药培养在规定培养基(琼脂固化)加2，4-D和KIN，转入只加KIN的再生培养基。并指出基因型对雄性发育反应的重要性，最好的供试基因型再生频率可达3%花药。
Dumas De Vaulx等(1981)采用Sibi等法发现在一年生辣椒花药培养(35℃)启动时期增高温度处理，可刺激雄核发育反应。这种结果与Keller等(1979)用油菜所得结果相似，指出温度与花药培养反应有强的互作。当用了35℃处理，启动培养基中2，4-D用量可降低。高温刺激可提高最适反应基因型再生频率达每个花药产生40株。
Dumas De#Vaulx等(1982)描述了从异质杂种花药培养产生的TMV敏感和抗性加倍单倍体系分布。从TMV抗性和敏感性CV的杂种取得的212加倍单倍体(DH)中，大多数DH是1：1分布，有些系抗性子代较少。这些结果证实了花药培养改变了基因分配。
Yamada等(1983)指出生产次生产物是另一重要领域，包括选择超产需要化合物的细胞系，鉴别培养要求，将提供产生这类物质的细胞生存力的最适条件。
Xeoman等(1980，1982)用木本辣椒细胞广泛研究培养基的营养操作，以增高辣椒素水平。辣椒素是从苯丙氨酸和缬氨酸形成。二者是蛋白质合成所需，为生产辣椒素所需的这些氨基酸造成限制，苯丙氨酸也是木质素生物合成途径的中间产物，其可给性更受限制。Yoeman等采用降低培养基的氮水平(5%MS水平)和不用蔗糖使缬氨酸和苯丙氨酸用于辣椒素合成而避开蛋白质合成。用前导物放射性饲喂试验指出在上述细胞培养基中掺入辣椒素的放射性大量增加。
用前导物如香草胺和异己酸加入培养基也能增高辣椒素水平100倍。还发现在藻酸盐内固定的细胞而不是采用平床培养基也能增多辣椒素生产。二者辣椒素水平相似。平床技术使组织量增高5倍，指出藻酸盐包裹的细胞生产辣椒素效率更高，或辣椒素是在负返馈控制下合成的。
(二)培养程序
1．原生质体分离和培养(Saxena等，1981)
(1)用50%Clorox表面消毒种子30min，无菌蒸馏水淋洗3次。放在MS基础培养基发芽。
(2)从充分发育幼苗切取茎尖，培养在MS加KIN 14．0μM，IAA 2．9μM和7．0%CW。
(3)把叶组织(15日龄叶，400mg)切成2mm小片，培养在MS盐类溶液中(稀释10倍)，2%纤维素酶(OnozukaR-10)，macerozyme0．4%(R-10)和0．5M甘露糖醇，8-10h。
(4)用吸移管轻轻转移原生质体到15ml无菌圆锥形离心管，反复离心(3次)洗原生质体，55×g，加倍养基NT盐类和维生素，4．5μM 2，4-D，5．4μM NAA，4．4μM BA和0．5M甘露糖醇。
(5)洗后，调节原生质体密度到5．0×104细胞／ml，取0．2ml几滴培养在二层用0．7%琼脂固化培养基之间，装在无菌9cm塑料培养皿中，暗培，25℃，15天。
(6)当愈伤组织将产生时，把细胞簇转移到甘露糖醇降低的(0．25M)新鲜培养基。为了芽再生，愈伤组织转入MS加22．0μM IAA，1．86μM KIN，和87μM蔗糖。再生植株放在加22．0μMIAA和0．12μMKIN培养基上生根。
2．从外植体再生植株
(1)用50%Clorox表面消毒种子50min，无菌蒸馏水洗3次，无菌接种琼脂固化MS上。
(2)从无菌种子取出胚，直接用作外植体，或从4周龄幼苗切取下胚轴和子叶。
(3)外植体培养在MS加8．8μM BA和5．7μM IAA。
(4)取6周龄芽转入MS加2．9μMIAA，生根。
(5)带根芽移入土中，保持在高温度中5天。
3．花药培养
(1)供体植株应保持在高光强(16h日)(3000-5000lx)，25℃。最好用生长箱。应从幼植株上取花药由于花药数随供体年龄而减少。
(2)取花芽，花药含单核期小孢子。用醋酸洋红染色鉴定。可从芽形态相关选择(花冠与花萼等长)，但这只是估计。
(3)花芽培养在4℃、高湿度2天。培养后再次核实小孢子发育期。
(4)用10%Clorox表面消毒花芽20min，无菌蒸馏水淋洗3次。从芽取出花药，培养在Sibi等(1979)培养基加0．045μM2，4-D，3%蔗糖和0．8%琼脂。
(5)暗培8天，35℃，继之培养在25℃，16h光周期。
(6)接种后12天，花药转入新鲜培养基，产生胚。胚转入新鲜培养基发育成再生植株。
(7)再生植株移栽入土，保持高湿度下，逐步降低。取旺盛生长中的根尖，放入0．1%秋水仙素(w／v)，4h，用乙醇：醋酸3∶1固定。用0．1M醋酸钠(pH4．5)淋洗根尖，1N HCl水解2h。再次淋洗根尖，用改进的碳化碱性洋红染色。
(三)成败关键
根据实验结果，组织发育时期是从胡椒培养的外植体取得再生芽成功的关键。一般未观察到基因型专化问题。事实上，所有胡椒再生的报道，都用了不同品种。荷尔蒙以8．0μMBA与5．0μM IAA配合为宜。
胡椒花药培养再生植株的重现，有许多因子是重要的。基因型似是最关键。虽然有些品种曾产生极好结果，其它则难予控制。最重要的是保持供体植株处于最适环境中。环境似乎可变的，视品种而异，可能包括在观察到的基因型专化中。
原生质体研究做得还少，但Saxena等(1981)指出的供体植株生长中，光强显然是取得成功的关键。
(四)展望
胡椒组织人工培养虽取得一些成果，仍有相当多工作要做。从体细胞组织再生植株，还不足用于应用(如体细胞克隆变异)的常规技术。事实上，从幼苗组织成功地取得再生植株的学者们，以用于无性繁殖评价他们的技术。
应采用未分化愈伤组织测验从幼苗组织再生植株所需变值，如高水平细胞分裂素，外植体组织发育时期。Morrison研究指出Saxena等(1981)方法不易重现。由此可知，原生质体产生的愈伤组织(培养的供体材料)再生植株鉴定的关键因子，可能与上述从外植体再生芽的因子相配合，以取得从愈伤组织再生植株的有效、可重现方法。这种方法将成为各种技术应用的基础，如突变体分离和原生质体融合。
胡椒花药培养产生单倍体植株，基因型很重要。为了通过雄核发育取得育种新系，必须能从有直接价值的基因型产生之。这个问题可用F1杂种花药培养克服之，至少有一个杂种亲本表现充分的雄核发育反应。产生大量小孢子产生的植株能力，与体细胞杂交和人工培养突变体分离相配合，将提供常规育种方法所未能取得的新奇胡椒基因型。
【参考文献】：
〔1〕Agrawal，S．and N．Chandra 1983 Differentian of multiple shoot buds and plantlets in cultured embryos of C．annuum var．Mathani．Curr．sci．52∶645-646．
〔2〕Dumas DeVaulx，R．D．Chambenett and M．Sibi 1981 Culture in vitro d′antheres de piment(Capsicum annuum)∶Amelioration de laux d′obtention de plantes-chez diffenert genotypes par de traitments A+35℃，Agronomie 1∶859．
〔3〕Gunay，S．and P．S．Rao 1978 In vitro Plent reganeration from hypocotvl and cotyledon explants of red pepper(Capsicum)．plant Sci．Lett．11∶365-372．
〔4〕Saxena，P．k，R．Gill，A．Rashid and S．C．Maheshwari 1981 Isolation and culture of protoplasts of C．ann uumL．and their regeneration into plant flowering in vitro．Protoplasma 90∶357-360．
〔5〕Sibi，M．，R．Dumas De Vaulx and D．Chambooett．1979 Ubtention de plantes haploides par androgenese in vitro chez le piment(Capsicum annuum)．Ann．Amelior．plant 29∶583-606．
〔6〕Sondahl，M．R．，D．A．Spahlinger，and W．R．Sharp 1979 A histological study of high frequency and low frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of Coffea arabicaL．Z．pflanzenphysiol．94∶101-108．
〔7〕Sondahl，M．R．，L．S．Caldas，S．B．Maraffa and M．R．Sharp 1980 The physiology of in vitro asexual embryogenesis．In∶Horticultural Reviews(J．anick，ed．)pp．268-310．AVI Publ．Westpart，Connecticutt．
〔8〕Sondahl，M．R．，L．C．Monaco，and M．R．Sharp 1981．In vitro methods applied to coffee．In∶Tissue Culture and its Application in Agriculture(T．Thorpe。ed)pp．325-358．Academic Press，New York．
〔9〕Staritesky，G．1970 Embryoid formation in Callus cultures of coffee．Acta Bot．Neerl 19：509-514．
〔10〕De Greef，W．and M．Jacobs 1979 In vitro culture of the sugar beet．Description of a cell fine with high regeneration capacity．Plant Sci Lett．17：55-61．
〔11〕Hosemans，D．and D．Bossoutrot 1983 Induction of haploid plants in vitro culture of unpollinated beet ovules(Beta vulgaris L．)Z．pflanzen zuchtg．91：74-77．
〔12〕Hussey，G．and A．Hepher 1978 Clonal propagation of sugar beet plants and the formation of polyploids by tissue culture，Ann．Bot 42∶447-478．
〔13〕Saunders，J．W．1982 A flexible in vitro shoot culture propagation system for sugar beet that includes rapid floral induction of rancetes．Crop．Sci．22：1102-1105．
〔14〕Heinz，D．J．，M．Krishnamurthi，L．G．Nickell，and A．Maretzki 1977 Cell，tissue and organ culture in sugarcane improvement．In∶Applied and Fundamental Aspectsof plant cell，Tissue and Organ Culture(J．Reinert and Y．p．S．Bajajeds)pp．3-17．Springeo-Verlag，Berlin．
〔15〕Larkin，P．J．and W．R． Scowcroft 1981 Somaclonal variation∶A novel source of variability from cell cultures for plant improvement Theor．Appl．Genet．60∶197-214．
〔16〕Liu，M．C．1981 In vitro methods applied fo sugarcane improyement．In： Plant Tissue Culture∶Methods and Applications inAgriculture．(T．A．Thorpe，ed．)pp299-323，Academic press，New York．
〔17〕Reinert J．and Y．P．S Bajaj(eds．)1977 Applied and Fundamental Aspects of plant cell，Tissue and Organ Cultures，Springer-Verlag．Berlin．
〔18〕Stevenson，G．C．1965 Genetics and Breeding of Sugarcane．Longmans，Green and Co．．London．
〔19〕Thorpe，T．A(ed．)1981．Plant Tissue Culture∶Methods and applications in Agriculture．Academic Press，New York．