橡胶树
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第733页（13374字）
橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg)属大戟科，原产于南美洲阿马逊盆地热带雨林，仅有100年栽培历史，大规模种植始于80年前。它是异种间杂种，染色体基数9(x=9)的双二倍体。有9个种：橡胶树，栽培种高产可适应；圭亚那橡胶树，生长旺盛低产；3．边沁橡胶树，抗南美叶柄和Phytophthora落叶病，优质、感冷，低产；4．少花橡胶树，树高中等，高抗病性；5．硬叶橡胶树，弱树，低产；6．色宝橡胶树，低产、旺长，与橡胶树高度可杂交；7．光亮橡胶树，耐旱，能在沙土生长；8．小叶橡胶树，很低产，生长中等；9．坎普橡胶树，矮树，耐旱，可用作育种的矮源。
(一)适用的组织培养技术
1．花药培养 直接用于培育新品种 橡胶树品种是高度杂合性的，小孢子中具有广泛分离体。可望取得优越基因型的花粉再生植株。同源二倍体花粉再生植株可直接用于作物改良。此外花药培养有可能产生非整倍体和异倍体，以及花粉再生植株上产生非整倍体和异倍体芽，可用育种的极有价值种源。
利用纯系产生杂种优势 采用花药培养可在短时间内(常规自交频率极低万分之几，并需5-7年才开花)取得不同基因型纯系，为产生杂种橡胶：高产、抗病、一致性有性品系铺平道路。
利用单倍体细胞系 单倍体细胞系只有一组染色体，有利于诱变和突变选择、产生杂种细胞和遗传工程。
2．组织培养
(1)诱导和筛选突变 诱变与组织培养相结合，可大大降低染色体嵌合现象，由此在培养中可产生单纯突变的多倍体或异倍体完整植株。并可在细胞水平上建立选择系统，以鉴别抗、耐病、冷、旱性。加强这种效果。
(2)繁殖优树 茎尖培养可加速优树繁殖，提供根系发达的大量优株。
(3)产生选缘杂种 胚培养可取得远缘杂交的胚和植株。可将外源优性掺入栽培橡胶树。
(二)研究进展
早在1966年Chua报道了培养基中渗透浓度，碳水化合物和pH值对诱导橡胶幼苗胚芽组织愈伤组织生长的影响。马来西亚橡胶研究所大规模橡胶组织培养，建立了各种外植体愈伤组织培养体，并能成功地保持反复继代。花药体细胞组织愈伤组织形成胚，液培茎尖和种子胚取得了带根植株。1972，1973年花药组织和花粉粒培养4-5周后产生愈伤组织。在6个月内，用同样培养基继代6次，保持生长良好。
1975-1976年橡胶幼树茎外植体愈伤组织培养物保持长期一系列继代。当系列繁殖的悬浮体保持在原培养基中，较大细胞团产生胚状结构。
1977年培养在MS和土壤中的茎切断和花药以及无子叶胚产生的幼苗取得了组织。
从带芽幼苗茎切段和无子叶胚取得了完整植株。有些移栽成功。1977从巴西橡胶花药培养首次取得5株花粉再生株。以后系统地研究花药培养培养体倍数性变化和小孢子成胚。已取得成百花粉再生植株，有些已克隆化。建立了花药培养技术，通常每接种百花药能形成百胚，最高149个胚。成活花粉再生株频率3%(1981)。此外，1982报道了橡胶未授粉胚珠取得2株再生株，其倍数性尚未测定。
(三)花药培养程序
1．一般程序 诱导花粉植株有三个步骤：①花药接种在诱导愈伤组织形成培养基上，小孢子生长，发育成多细胞团、单倍体胚或花粉愈伤组织。此时应注意小孢子发育以及各种因子的影响。②把约培养50天的花药愈伤组织转移到分化培养基，胚生长肉眼可见，或花粉愈伤组织分化成小胚，而后发育成肉眼可见的胚。培养20-25天后，花药为分生组织薄壁细胞所充满，后者是花药体细胞组织产生的。细胞学观察证明它们是二倍体(2n=36)，但培养50天后，体细胞愈伤组织衰老，而小孢子发生的胚和愈伤组织开始旺盛生长，迅速分裂。约有70%细胞是单倍体(n=18)。这是把花药愈伤组织转移到分化培养基的适当时期，以促进单倍体胚进一步发育和分化。③发育良好小孢子胚转入再生植株培养基，继续发育成完整再生植株。
每个胚经受的条件不同，如荷尔蒙水平，矿物质和有机成分，或胚位置不同，胚的形态一般不同步，观察到它们形态上的差异。诸如圆型、棒型、喇叭型和子叶型。其中喇叭型和子叶型更为正常。通常由此再生植株，棒型胚再生较少。
花药愈伤组织转入分化培养基约一月后肉眼可见其胚。但胚分化尚未完全。培养2-3月后，胚形成顶芽，所以不应过早转移，否则胚形成根而不是芽。
2．培养基成分
(1)无机成分 诱导橡胶花粉植株需要脱分化，分化和再生培养基。脱分化常用MS〔MS大元素和铁盐，和Bourgin和Nitsch(1967)烟草培养基的微量元素，维生素和有机成分〕和改进的MB培养基。二者都能诱导花药产生愈伤组织和小孢子发育成胚。一般改进MB比MB为好。荷尔蒙类型和用量二者相同。分化和再生培养基大元素量降低，微量元素用量比MS为高(表27-12和表27-13)。
表27-12 不同氮类型和用量对胚发育的影响
表27-13 橡胶树属花药培养培养基成分
若干因子对花粉胚发育和继后再生植株的影响。脱分化培养基的无机盐中以氮对小孢子影响最显着。曾发现小孢子脱分化与花药体细胞组织的愈伤组织化对氮(化学成分和用量)要求很不同(表27-13)。MS中
浓度对胚发育是可满足的。降低MS的
浓度有利于花粉胚发育。相反，花药体细胞组织发育要求较低水平NH4+，但不利于花粉胚发育，由于诱导花粉胚需要总氮水平较高(50．58-60．05mM显然可满足)。当总氮浓度降到30．03mM，花药愈伤组织百分比增高到80%，胚降到0．8%。
试验指出愈伤组织和胚形成要求高水平KH2PO4。3．75mM KH2PO4二者频率最高。比MS的1．25mM和2．5mM为优越。此外，生长在3．75mM KH2PO4培养基的比较低KH2PO4浓度培养基的生存率要高很多。
(2)荷尔蒙脱分化培养基加9．3μM KIN和9．0μM2，4-D足以诱导相当频率的花药愈伤组织(表27-14)。但小孢子脱分化和发育成胚，要加三种荷尔蒙(4．6μM KIN，4．5μM2，4-D和5．7μM NAA)。指出三者对形成多细胞团有显着正效应，与加NAA相比，诱导频率加倍。加5．7μM NAA比2．7μM的为好。
表27-14 橡胶树属细胞培养培养基中生长调节剂和其它成分
最后pH5．8用1M KOH或0．2N HCl调整
接种在加2．7μM NAA培养基的1166花药，只产生160胚(14．2%)。同时，5．7μM NAA上的1073花药，取得245胚(22．8%)。其中大部分细胞是单倍体2n=18，不加NAA的培养基诱导产生的胚细胞，85%染色体数为28-36。
分化培养基要加KIN、NAA和GA。KIN浓度尤为关键。不加KIN时，胚诱导率降低，并不能发育成芽。同时附加1．1μM NAA和4．6μM KIN，对小胚生长成大胚有显着正效应。适量GA促进胚生长，形成子叶。不加GA，胚很小，许多反常，子叶畸形。
(3)蔗糖 脱分化培养基蔗糖用量对花粉粒生存率和形成花粉胚是重要的。当增高到10%，体细胞增殖不快，形成愈伤组织花药很少，花粘粒生存率虽有增加。加蔗糖3%的，花药体细胞愈伤组织生长很旺，抑制形成花粉多细胞团，由此诱导率也低。花药里有许多未发育花粉粒。
蔗糖用量7-8%，至少有50%花药形成愈伤组织。蔗糖水平也能抑制愈伤组织生长，由此促进花粉粒发育，结果胚形成率最高。
分化培养基蔗糖用量以7-8%最适宜。降低用量会使体细胞恢复旺盛生长，抑制胚发育和顶芽分化。再生培养基最适蔗糖用量是4-6%，有利于胚发芽和根、芽生长。
(4)椰乳 在附加KIN和2，4-D培养基中附加椰乳，抑制培养的花药体细胞增殖。加10%CW，形成愈伤组织诱导频率比不加的要低得很多。一般规律，培养基CW愈高，诱导形成愈伤组织频率愈低。可是，5-10%CW同时加4．6μM KIN，4．5μM 2，4-D和5．7μM NAA能显着增高花粉胚诱导频率。
3．接种选材 花药培养各阶段要注意防止污染。
(1)选择小孢子正常、有发育潜势品种作为供体。
(2)接种用橡胶花药以单核期最好。
(3)不取雨后花芽接种。
(4)接种前冰箱存放花序，对小孢子组织有负效应。例如从3-11℃存放20-24h花序取花药培养，发现许多小孢子外壁失去张力(呈三角形)，核染色模糊。它们不能发育成胚。但其体细胞正常增殖，从花药愈伤组织产生的胚大多数是二倍体。
(5)显微镜观察测定花药发育时期。3-3．5mm花芽中大部分花药是单核期，可取备用。
4．培养基制备
(1)无机盐和有机化合物要用最纯级的。
(2)双蒸馏水，用玻璃蒸馏器。
(3)取10mg 2，4-D溶于2ml乙醇，稍加温，用水100ml逐渐稀释。冰箱储存，NAA溶法同。
(4)取10mg KIN溶于少量0．5N HCl，稍加温，用蒸馏水100ml稀释之。冰箱储存。同法溶化
基氨基嘌呤。
(5)取10mg 5-溴尿苷溶于100ml双蒸馏水，稍加温。
(6)叶酸溶于少量氨溶液中，用双蒸馏水逐渐稀释。
(7)上述全部母液应储存在A℃冰箱中，立即取用。
(8)取12ml脱分化培养基倒入20×200mm试管中。25-20ml分化培养基或再生培养基装入30×200ml试管中。加棉塞，蒸气高压120℃消毒20min。消毒后立即取去冷却。
5．材料消毒
(1)组织浸入70%乙醇(烧杯)1min。
(2)除去乙醇，加0．1-0．2%HgCl2溶液。10-12min，或加10%商用漂白粉，30min．
(3)用双蒸馏水淋洗组织4-5次。
6．接种
(1)各种用具蒸气高压消毒，烘箱烤干。
(2)接种前将载玻片加热，放进培养皿。接种花药。每试管约接种25-30个花药。
(3)花药在培养基上应分布均匀。
(4)培养室26℃。动作要快，每张载玻片用一次。
7．花药愈伤组织继代
(1)估计接种花药数量，决定制备培养基量。
(2)当花药开始形成愈伤组织时，以每试管约4个花药，分移到3-4试管中。
(3)转移不要将花药倒置。
(4)培养室26℃。
8．胚转移
(1)将无菌载玻片放入培养皿。
(2)把带胚愈伤组织移至载玻片上，从愈伤组织上轻取发育良好的胚。转移到再生培养基中。将余下的带小胚愈伤组织转移到新鲜分化培养基上。
(3)培养温度27-28℃，12h光照(22400 lx)。
9．组织学观察 醋酸洋红涂片法
(1)用1克洋红溶于100ml 45%醋酸中，放入回流凝结器三角瓶，沸3-4h，冷却，过滤。4℃冰箱存放。
(2)将花芽放入固定液的指形管。
(3)在载玻片上从花芽取出花药，加4%铁明矾预染1 min后吸干。
(4)破碎花药，加一滴醋酸洋红，加盖玻片，显微镜观察。
10．组织学观察 PICCH染色
(1)100ml丙酸加0．5g洋红，放在回流凝集瓶中，沸3-4h，冷却、过滤。
(2)5ml丙酸洋红溶液中加2克三氯乙醛水溶液，搅动，直到完全溶解。
(3)加Fe(OH)3饱和的丙酸溶液几滴。
(4)将材料放入装固定液95%乙醇∶氯仿∶丙酸(6∶3∶1)指形管，放置12-23h。
(5)95%乙醇淋洗几次。
(6)将材料放在载玻片上，加几滴PICCH(丙酸-铁-洋红-三氯乙醛水溶液)，加盖玻片观察。
11．细胞学研究
(1)取新鲜愈伤组织，胚或再生植株根尖，取样时间上午11∶50-12∶00，室温下用0．003M8-羟苯醌，预处理4h。
(2)把材料转移到乙醇-冰醋酸(3∶1)中，固定24h。
(3)将组织放入盐酸-乙醇(1∶1)水解，水解40min。
(4)将组织转移到铁明矾(4%)0．5h。
(5)苏木精染色2h。。
(6)放在40%醋酸中涂沫观察。
2．花粉再生植株移栽 移植成功要点如下：
(1)主根和侧根必须发育良好。衰老根或发育不足根再生植株生存率很低。在再生培养基加1．1μM NAA有助于根系发育。
(2)移栽前应加锻炼。去塞暴日光2天。
(3)植株第一轮叶长出成为成熟叶后移植。
(4)土壤结构好，不太粘，以肥土∶沙(4∶1)为宜。
(5)洗根，浸入0．188mM NAA和0．2mM IAA，或0．114mM IAA和0．088mM IBA15-30min，有利栽后根系发育。
(6)移栽要快1-2min。
(7)移栽后室温25-30℃，保持高湿度。汞灯(500W)照光，每天15h。
(8)待植株长出新叶，放在日光(7∶00-10．00a．m．和4∶00-6．00p．m．)炼苗2周。此后移植大田。
培养物和移栽花粉植株细胞学观察结果如下：
①胚．细胞学研究证实花药培养成苗是来自花粉粒。约80%有丝分裂中期染色体是18。约16%为27，3%为9，约1%为32，36或45。大多数是9的倍数。
②根尖细胞．观察指出32%中期染色体为18，59%为27，4%为9。此外，也看少数非整倍体。在胚培养期间染色体数有逐渐增多趋势(表27-15)。
表27-15 再生植株的胚和根尖的有丝分裂中期染色体数观察
③幼叶．移栽花粉植株(高50cm以下)幼叶细胞学观察指出，大部分中期染色体数为18-27，未见有36的。苗高160cm的叶，染色体36以上植株增多，其中51%叶细胞为28-36，44%为18-27(表27-16)。可能指出活体上染色体数逐渐增多。移栽植株的不同染色体数细胞频率连续改变，虽整倍体数仍占优势。取其芽繁殖将有可能分析来源于不同正倍体和非正倍体组成的芽的茎叶的染色体变异。
表27-16 移栽花粉植株幼叶细胞中期染色体数
(四)其它外植体培养程序
1．茎尖 Paranjothy等(1975)报道2-4周龄幼苗和幼克隆植株取茎尖，用5%商用漂白粉消毒5min，无菌蒸馏水淋洗几次。除去鳞片和小叶，茎尖再消毒一次。培养在0．087M蔗糖培养基4天，以保证无菌状态，切取(长2-3mm)茎尖上部，培养在MS加0．087M蔗糖和水解酪蛋白。4周内形成带根再生植株，但幼克隆植株茎尖未见发育成株。成年植株茎尖培养未见成功报道。
2．茎切段 Chen等(1975)切取带芽茎切段长4cm。除去大叶，浸入10%商用漂白粉20min。无菌蒸馏水淋洗4-5次，切成0．5-1cm小段，切除转白部分，将切端插入培养基。如用液培，用脱盐滤纸做成平台架，放进试管，刚在液体培养基表面之下。
改进的Nitsch培养基最适于茎段培养。添加KNO33．0mM对芽发育成再生植株有正效应。维生素对再生也是重要的。
3．未授粉胚珠 Guo等(1982)培养未授粉胚珠诱导再生植株方法如下：
从花序取单核小孢子雌花。用0．1%HgC12消毒，无菌蒸馏水淋洗4-5次，鉴别胚珠用于接种。MS为基础培养基加蔗糖146-292mM，pH5．8。脱分化培养基加KIN 2．3-5．5μM，2，4-D 2．3-5．4μM和5-10%CW。分化培养基加KIN 2．3-4．6μM和NAA 0-11．0μM。再生培养基加GA 1．4-7．9μM。
培养第六天胚珠开始增殖，有些转褐，死亡，其它破子房壁而出，发育成愈伤组织。在脱分化培养基50-60天后，愈伤组织转入分化培养基。约15天后肉眼可见胚，在分化培养基继续生长60天，然后转移到再生培养基，已得一株完整再生植株。
4．胚从成熟或未成熟种子取胚，消毒。在超净台或灭菌室切除胚乳和子叶，将胚接种在培养基上。
培养基含有MS大元素，微量元素加倍，附加KIN 0．5-0．9μM，NAA或IBA分别为1．1μM和2．5μM和GA 1．4μM。大部分胚能出芽。无子叶胚出芽比有部分子叶胚要难得多。Toruan(1977)报导从无子叶胚在MS上长成幼苗，然后在土中生长。
5．悬浮细胞 Paranjothy等(1975)从花药体细胞愈伤组织建立了细胞悬浮培养物生长在100ml T型管中，或乳头三角瓶，旋转振荡2rpm。MS加BA 4．4μM和2，4-D 4．5μM。培养基稀释2倍，能促进细胞生长，但尚未取得类胚结构。
6．上胚轴、下胚轴和子叶小片 上胚轴、下胚轴和子叶小片培养易生根，即使是MS加低水平荷尔蒙或不加荷尔蒙。三碘苯甲酸(TIBA，0．2μM)抑制生根，2，4-D促进愈伤组织形成，KIN+2，4-D引起愈伤组织旺盛生长。
(五)展望
为了采用花药培养技术于作物育种，必需增多能产生花粉植株的品系数，加强不同品系花粉再生植株诱导频率。胚珠培养取得再生植株倍数性和来源尚待研究，如果从未成熟胚珠内小孢子能诱导产生单倍体植株，则可从雄性不育品系取得单倍体或同源二倍体系。从茎尖和成熟植株形成层培养产生大量再生植株方法，也对种植和育种很有用。此外，必须建立和采用从细胞悬浮体和原生质体再生植株技术和应用细胞遗传技术于橡胶树改良。
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