紫外分光光度法测定胰蛋白酶的活力

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《皮革工业手册制革分册》第617页（1681字）

胰酶是自猪、羊、牛等动物的胰脏中得到的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶、胰淀粉酶及胰脂肪酶。为了能更准确而快速地测定出胰酶对蛋白质的水解能力，采用紫外分光光度法是可行的。

1．原理

具有共轭双键的化合物在近紫外区，对于一定波长的光有很强的吸收。其吸光度在一定范围内与该化合物的浓度成直线比例关系。蛋白质及其水解产物(酪氨酸、色氨酸等)中含有共轭双键。

以酪蛋白为底物，在一定的pH值、温度条件下，在单位时间内，一定量的胰酶与其作用所产生的蛋白分解产物的多少和吸光度成正比。所产生的酪氨酸越多，吸光度越大，从而计算出胰酶的活力。

2．试剂

(1)氯化钙溶液：称取1．47g分析纯氯化钙，加水500mL，使之溶解，用0．1mol·L^－1HCl溶液或0．1mol·L^－1NaOH溶液调节pH值至6．0～6．2。

(2)硼酸盐缓冲液(pH值7．5)：取硼砂2．85g、硼酸10．5g及氯化钠2．50g，加水溶解至100mL。调节pH值为7．5±0．1。

(3)5%三氯醋酸溶液。

(4)酪氨酸标准液：精确称取已在105℃下干燥至恒重的酪氨酸5mg，加入0．2mo1·L^－1HCl溶液，溶解至100mL。

(5)酪蛋白溶液：称取酪蛋白1．5g，加入0．1mol·L^－1NaOH溶液13mL，水40mL，在60℃的水浴中溶解，放冷后加水稀释至100mL，调节pH值至8．0。

(6)分析试液的配制：精确称取适量的胰酶，置乳钵中，加入冷至5℃以下的少许上述氯化钙溶液，研磨均匀，移至100mL容量瓶中，再加氯化钙溶液至刻度，摇匀。从中量取10．0mL，用冷至5℃以下的硼酸盐缓冲液稀释至每1mL中含胰蛋白酶约0．12单位。

3．测定

(1)准确吸取试液1．0mL于试管中，加硼酸盐缓冲液2．0mL，在40℃水浴中保温10min，准确加入在40℃水浴中预热的酪蛋白溶液5．0mL，摇匀，立即置40±0．5℃水浴中反应30min。精确加入5%三氯醋酸溶液5．0mL终止反应，摇匀，过滤。取滤液在275nm波长下测定吸光度A(以过滤的5%三氯醋酸液溶5．0mL及硼酸盐缓冲液8．0mL的混合液作对照)。

(2)准确量取分析试液1．0mL，加硼酸盐缓冲液2．0mL，在40℃水浴中保温10min，准确加5%三氯醋酸5mL，摇匀，置40℃±0．5℃水浴中准确反应30min，立即准确加入酪蛋白溶液5．0mL，摇匀，过滤，取滤液按上述方法测定吸光度为A₀。

(3)用0．2mol·L^－1HCl溶液作对照，在275nm波长下测定酪氨酸对照溶液的吸光度A_s。

4．计算

在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成三氯醋酸不沉淀物在275nm的波长时，与1μmol酪氨酸相当的酶量为1活力单位，则

每克样品所含胰蛋白酶单位

式中 m₁——每1mL酪氨酸对照溶液中含酪氨酸的质量(μg)；

m——样品取样量(g)；

n——样品的稀释倍数。