DNA的化学合成

出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第846页（2573字）

化学合成DNA是用已经保护好的单核苷酸或二核苷酸、三核苷酸为基本原料，用化学的方法将它们连接起来，形成一定大小的单链寡核苷酸片段，单链寡核苷酸片段通过酶法或化学法可以进一步形成DNA。

1955年，托德(A．R．Todd)等首次合成具有3’－5’磷酸二酯键结构的TpT。1956年，霍拉纳(H．G．Khorana)等用对苯磺酰氯(Trt)为试剂，将(Trt)T和pT缩合形成(Trt)TpT，脱去Trt后得到TpT。霍拉纳等发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基以及一些缩合剂，从而建立了寡核苷酸合成的磷酸二酯法，用此方法合成了大量由一种、两种或三种脱氧核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段。霍氏的磷酸二酯法是用保护的核苷磷酸单酯同另一保护核苷的羟基缩合形成磷酸二酯的方法，由于核苷间的磷酸没有保护，该未被保护好的磷酸羟基可以与磷酸单酯反应形成多种焦磷酸衍生物，导致磷酸组分的消耗和寡核苷酸链断裂；同时，由于合成时副产物较多，不易进行产物纯化。

另外，磷酸二酯法只适于液相合成而不适于固相合成，无法实现合成自动化。1966年，莱德辛格(R．L．Letsinger)等在托德(1955)的工作基础上建立和发展了磷酸三酯法。

磷酸三酯法采用磷酸二酯法中的羟基和氨基保护基，同时寻找一些磷酯保护基并研究它们的导入和脱除条件，发现了一系列能使磷酸二酯活化的高效缩合剂。磷酸三酯法副反应少，产物易于纯化，并能用于固相合成，但每次偶联反应达15分钟至2小时，连接产率只能达到95%，合成的片段只有20个左右核苷酸大小。

1976年，莱德辛格首次提出亚磷酸三酯法。1981年，马泰乌奇(M．D．Matteucci)等对该法作了改进并发展成为固相的亚磷酸三酯法。

该法的基本偶联单位为3’端的亚磷酸核苷酸，偶联后用碘(I2)将偶联产物亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯，该法反应时间比磷酸三酯法至少短8／10，连接产率达98%，可以合成50个核苷酸大小的片段；但由于核苷间的磷酸保护基为三氯乙基，带氯原子的亚磷酸反应物具有很高的活性，给制备和处理带来困难，也易产生副反应。1981年，博康基(S．L．Beaucage)等采用二烷基胺替代亚磷酸中间体上的氯原子形成亚磷酰胺化合物，解决了以上矛盾。

该亚磷酰胺化合物十分稳定，当用四唑活化时，几乎不产生副反应，偶联时间不超过2min，偶联产率达99%，合成片段可达100个核苷酸以上。

DNA的固相合成技术是1973年伊塔库尔(K．Itakura)借鉴多肽的固相合成技术发展起来的。在磷酸三酯法特别是亚磷酸三酯法和亚磷酸酰胺法取得成功后，DNA的固相合成技术取得巨大的进展。固相合成是将待合成DNA链的3’端第一个核苷酸固定于一个不溶性的高分子面上，然后根据不同载体选用不同化学试剂洗脱除去核苷酸5’端的保护基，将第2个待连接的核苷酸用四唑活化，活化后的3’端磷酸基与第1个核苷酸的5’端羟基偶联，每接长一个核苷酸经历一轮循环，接长的链一直连接在不溶的固相载体上，除去未反应物或分解产物，当整个链长增加到所需的长度后，再将寡核苷酸链从固相上切下来，脱去保护基即可分离纯化得到所需的最后产物。

在固相合成中，每一轮偶联反应除了所用的单核苷酸不同外，其它操作过程和试剂均相同，可采用机械的仪器来完成。将4种(dA，dC，dt，dG)保护的单核苷酸或其它试剂密封于试剂瓶中，将各个试剂瓶用连接管与装有第1个核苷酸的固相载体反应柱相连通，然后按一定顺序即可完成合成循环。

很多高度自动化的合成仪采用微电脑控制，只需事先将合成片段的碱基顺序输入电脑，电脑就会按固定顺序依次控制合成。美国应用生物系统公司生产的393A型的和394A型的合成仪可以同时合成3个和4个DNA片段，大大提高了合成效率。

世界上其他公司贝克曼(Beckman)、法默西亚(Pharmacia)等生产的DNA合成仪也各具特点。随着生物技术和电脑技术的发展，预计自动化程度更高的合成仪将会被研制出来，合成时各个指标将会得到进一步的提高。

DNA的化学合成已在分子生物学、医学、农业和发酵工业等方面得到广泛应用。自1977年伊塔库尔首次合成14肽的生长激素释放抑制素基因并在大肠杆菌中表达以来，一些有生物活性的多肽和蛋白质基因如胰岛素、生长激素、干扰素、生长激素释放因子、胰腺素、舒缓激肽、脑啡肽、抗菌肽等基因相继被合成并获得表达。

由于合成试剂和材料的商品化，合成仪的自动化，原则上任何已知结构的基因都可以合成。DNA的化学合成除为人工合成基因提供一条途径外，还用于基因突变和蛋白质的结构功能研究以及基因的改造和核酸结构研究；在基因工程中用作接头、探针和引物等，并已用于植物病害的普查以及医学上传染病和遗传病的诊断。总之，化学合成的DNA目前已发展成为现代生物学研究的有用工具，将为进一步解决生物学及医学中的重大理论问题作出贡献。

【参考文献】：

1 Letsinger R L J. Am Chem Soc.1976,98:3655

2 Itakura K.et al. Science. 1977.198:1056-1063

3 Matteucci M D.et al. J Am Chem Soc, 1981,103:3185

4 Beaucage S L,el al. Tetrahedrron Letters, 1981,22:1859

5 熊克勇，等．武汉大学学报(生物工程专刊)，1990，12∶1～6

6 王美岭，等．基因合成及其应用．济南：山东大学出版社，1991

(中国科学院武汉病毒所胡勤学撰；胡康洪审)