超声诱导基因转移
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第916页（3135字）
植物基因工程的关键技术之一，是将外源基因导入植物细胞。
离体植物遗传转化方法，主要有(1)农杆菌Ti或Ri质粒介导法；(2)磷酸钙核酸沉淀吸收法；(3)PEG介导DNA直接转移法；(4)脂质体载体法；(5)显微注射法；(6)电激基因转移法；(7)基因枪喷射法；(8)激光微束法等。而超声波法操作简便，设备便宜，不受宿主范围的限制，特别是它能将外源基因直接导入植物组织或带壁细胞。鉴于植物组织培养再生植株比原生质体再生更为成熟，因此超声波直接导入外源基因法可能适用于更多的物种。
1989年以来，中国农业科学院生物技术研究中心细胞室章力建、陈乐玫与清华大学生物科学技术系许宁等合作，发展了一种新的转基因方法——超声波法，可将外源基因直接导入带壁细胞。
1990年6月，他们在世界上首次报道了利用超声波法将β葡糖苷酸酶(GUS)基因导入小麦幼穗愈伤组织，并获得30%的GUS基因短暂表达。为了建立完整的技术体系，进一步在模式植物烟草上进行研究。以白肋烟草试管苗的叶片为外植体，将其切成小块，放入加有缓冲液的超声小室中，加入含PCaMV35SGUS基因和Pnos．NPTII基因的PBI121．1质粒及鲑鱼精DNA，进行超声波处理。同时设置加质粒不做超声、超声不加质粒以及不加质粒不做超声处理3种对照。
结果超声转基因组GUS基因的短暂表达率高达80%以上，叶片组织的平均转化面积高达70%～80%。
获得转基因植株的频率，以起始外植体计算达到22．3%，R1代卡那霉素抗性及GUS酶活性检测证明外源基因已有性传递给子代。
1990年8月，丹麦Joersbo和Brunstedt也报告了用超声波法将CAT基因导入甜菜的和烟草的原生质体中获得短暂表达，发现超声波法所获得的短暂表达要比电激法高7～15倍。
综合分析国际文献报道，迄今已用农杆菌介导的基因转移获得成功的例子居绝大多数。
其中根癌农杆菌占60．9%，发根农杆菌占18%，两者相加几乎达80%。然而，农杆菌具有宿主局限性，可侵染大多数的双子叶植物，但只感染少数单子叶植物，因而目前在获得转基因植物的54个物种中，单子叶植物只有禾本科4个种。
由此看来，大多数禾谷类作物的基因转化仍是当今植物基因工程急需攻克的难关。
由于超声波法无基因依赖性，应用该法在禾谷类作物遗传转化方面做了不少尝试，并取得一定的进展。
清华大学生物科学与技术系和北京农业大学生物学院共同合作，以小麦幼胚(农大146号和京红5号)为外植体，将小麦幼胚置超声小室中，加入含PBI121质粒及鲑鱼精DNA的超声缓冲液，以0．5～2．0(W／cm2)脉冲超声波处理20～45min。处理后的幼胚在幼胚培养基上培养3个月后，超声处理后的幼胚分化出的愈伤组织中检测出GUS基因的表达，表达的最高频率达到67%。
进一步由愈伤组织分化出的部分苗中，也检测到GUS基因的表达，而且就GUS基因表达率而言，品种间无明显差异。同时，他们还将玉米(Zea mays L．cv．HL)幼胚进行超声处理，将幼胚置超声小室中，加入含PBI121质粒及小牛胸腺DNA的超声缓冲液，经0．5～1．0(W／cm2)的脉冲超声波作用15～45min后，转到含2．0mg／L2．4－D的N6培养基中培养。
10d后，在诱导出的愈伤组织中检测到GUS基因的表达，最高频率达40%。实验结果表明，超声波作用的时间和强度以及幼胚状态对转化频率均有影响。
为了探索超声波法在动物细胞及微生物细胞上基因转化应用的可能性，清华大学生物科学与技术系做了大量实验。他们以0．5～2．0(W／em2)脉冲超声处理衣藻细胞、红细胞、酵母细胞以及人体肺癌细胞，并分别将外源荧光物质钙黄素导入以上细胞。
这一实验结果表明，超声波法将在更广泛的领域中得到应用。
对于一个成熟、实用性强的转基因系统而言，必须具备以下条件：(1)高效，即获得转基因植株的频率高；(2)重复性高，即易于重复；(3)简易，即设备简单，易于操作；(4)快速，即由转化至获得转基因植株的时间相对较短；(5)无基因依赖性，即方法适用范围广，能在同一个植物种的许多基因型上成功，特别是在优良的栽培品种上成功。因为转基因的目的常常是希望以一个优良的栽培品种或有希望推广应用的品种(或品系)作起始材料，转进一个特定的目的基因，如抗病、抗虫基因等，使转基因植物既保留原有的各种优良农艺性状，同时又有一个新的目的基因控制性状。由于对超声波诱导基因转移的机理尚未研究清楚，目前在应用方面还存在着许多问题。
为了进一步完善超声波转基因系统，使其具备高效、重复性高、简易、快速、适应性广五大特点，近年来，清华大学生物科学与技术系和中国农科院生物中心细胞室合作，对超声波法的机理进行了探讨。他们在报告中初步认为，超声波的空化作用可能是造成基因转移的主要原因。空化作用发生时，可以使细胞膜产生局部的和暂时的结构改变，造成一系列的穿孔效应，溶液中的DNA分子可以借此扩散进入细胞。另外，在空化中心会产生局部的高温高压，这也可能使细胞壁产生局部穿孔，使得DNA分子能够进入带壁细胞。
在高等植物的许多组织中，细胞间的通道里往往存在着许多微小的气泡，这些气泡在超声波作用下将成为空化中心，从而对周围的细胞发生作用。由于这种气泡是普遍存在的，这就使得大量的细胞都能感受到超声所引起的空化作用。这可能是利用植物组织块进行超声基因转移效率比较高的重要原因。Potrykus在讨论作物基因转移中曾假设植物的细胞可分成对再生和转化呈感受态、或潜在感受态以及非感受态细胞。
只有对再生及转化呈感受态的细胞才能产生转基因植株。尽管这种假设还缺乏直接的实验证据，但若诱导因子能使更多的细胞摄入外源DNA，则细胞整合外源基因并再生成个体的机率也就越大。在超声处理中，由于超声波的反射和折射造成植物组织感受面积大，从而增加呈感受态的细胞，这也可能是造成基因转移频率比较高的原因之一。
超声波法确实是一个值得研究、很有前途的基因转移方法。今后主要的方向是弄清机理，在超声仪和转化系统上不断改进和完善，使其成为基因工程中基因转移的有力手段。
。【参考文献】：
1 贾士荣．江苏农业学报，1990，6(1)∶44～47
2 许宁，等．生物物理学报，1990，6(2)∶281
3 Joersbo et al．Plant Cell Reports，1990，9∶207～210
4 Potrykus l．Biotechnology，1990．535～542
5 许宁，等．第四次全国基因结构，克隆与表达学术讨论会文集．1991．3
6 章力建，等．中国农业科学，1991，24(2)∶83～89
7 Zhang Lijian，et al．Biotechnology 1991，9(10)
(中国农业科学院生物技术研究中心陈乐玫副研究员撰；章力建审)