植物花粉活体剥壁技术
出处：按学科分类—自然科学总论 北京出版社《现代科技综述大辞典上》第987页（3785字）
持指采用物理的或化学的方法简单而快速地除掉花粉粒的外壁，分离出大量具有活性花粉原生质体的技术。
这是近几年发展起来的新技术。花粉原生质体具有单倍性、结构简单、群体数量大从而构成一个天然单倍体系统及发育同步四大特点。
因此，被普遍认为是遗传操作、突变研究的卓越体系，是花粉生理学、个体发育、体外模拟受精、细胞杂交、外源基因转化等研究的重要材料。由于烟草、矮牵牛等植物花粉在培养基上诱导胚胎发生成功，这意味着从花粉原生质体诱导再生植株的可能性，自然也就成为作物育种研究的材料。
关键问题在于如何排除外壁的障碍，这一问题一旦解决，将大大地推动植物生物学、细胞工程、作物遗传育种等研究和生产应用。
近10多年来，对花粉发育的各个时期都有学者进行原生质体的分离研究。在小孢子母细胞至四分体时期其细胞壁质地为胼胝质，在花粉管时期其管壁质地为果胶质、纤维素和胼胝质。这两个时期均可用果胶酶、纤维素酶、胼胝质酶降解而分离出原生质体。
但从花粉时期(小孢子至花粉成熟)分离出活的原生质体成功者甚少，因为这个时期外壁发育业已完成，外壁质地为孢粉素，它是类胡萝卜素和类胡萝卜素酯的氧化多聚化的衍生物，质地坚固，具抗酸、抗碱、抗生物分解的特性，除掉外壁并保存花粉原生质体的活性是非常困难的。
早在20世纪70年代，Power(1973)、Bajai和Davey(1974)等实验研究除掉外壁分离出活性的花粉愿意生质体，他们对烟草及茄科、禾本科的几种植物进行实验，但效果不好。
1974年，Southworth试用30多种强酸、强碱、强氧化剂、洗涤剂、有机溶剂等分解外壁，发现仅有极少数试剂有效，但同时也杀死了原生质体。以后这方面的研究工作长期处于停滞状态。
到1985年，Loewus等用MMO·H2O(4－methyl morpho-line Noxide monohydrate)处理花粉，分离出大量的麝香百合花粉原生质体，但试剂和高温使原生质体严重失活。1983年，Bajai用解株酶、牛酶结合机械搅拌分离矮牵牛、烟草、小麦的成熟花粉具活性的原生质体。
1982年，朱徽、胡适宜等用离析酶(Macerozyme R10)和纤维素酶(Onozuka R－10)从烟草花粉管分离出活性的亚原生质体，继后以同法分离出金鱼草、木番茄、朱顶兰、王百合、渥丹、君子兰、烟草的花粉管的活性亚原生质体并作了培养实验。1987年，周嫦利用花粉水合作用导致外壁破裂，加超声波处理，用果胶酶、纤维素酶降解内壁分离出鸢尾、风雨花、萱草三种植物的大量的具活性的花粉原生质体，并进行了初步培养，观察到萱草花粉原生质体细胞壁再生、管状及其它多种结构的形成以及生殖核的一二次分裂。
综上所述，近10年来从花粉母细胞至四分体时期和花粉管时期用酶解法分离出较多植物的活性原生质体，而真正从花粉时期分离出活性的原生质体的植物还很少。
1985年以来，兰盛银、徐珍秀致力于花粉壁剥离观察研究，借助于自行研制的剥离溅射仪(ISC－A)产生的任意向散射离子的适当冲击将花粉粒的多层壁随机地剥开，暴露出多层壁的内外侧面置于扫描电镜下，观察到用常规方法无法观察到的掩盖于壁层结合面上的结构现象，获得200多种植物花粉被剥光外壁(仅存内壁)的原生质体，并对这种原生质体的表面形态结构进行了研究。
到1990年，已剥离观察了225种(75科)常见植物花粉粒。大量地剥壁实验证明，花粉粒外壁虽然坚固，但是其伸缩性极小，具有脆性，采用离子冲击技术比较容易将外壁除掉而获得仅由内壁包裹的花粉原生质体，内壁可以容易地用果胶酶和纤维素酶完全消化。这一阶段的工作为花粉粒的活性剥壁作了必要的准备。在此基础上自1991年开始转入花粉粒活体剥壁研究，主要采用两种方法：(1)冷冻花粉离子剥离法。对剥离溅射仪作适当的改进，将样品台的水冷却室改制成液氮冷冻装置，以管道连到机壳外，可随时加入液氮以冷冻样品铜台，并特制一套专用于剥壁的高压脉冲电源(2500～6000V，连续可调)。将成熟的新鲜花粉用10%的蔗糖液浸泡3～5min，使之充分吸水，再离心收回，置于滤纸上以吸去花粉粒表面附着水，再放到被液氮预冷的样品铜台上，花粉粒很快就被冷冻成冰粒，再罩上真空罩开机抽抽到6．67Pa托时，接通脉冲高压开关，并顺时针调整电压调节旋钮使高压指示约为4000～5000V，真空罩内便发出红紫色光柱，这是离子和金属粒子相互碰撞所致，这些离子和部分靶电极发出的铂粒子冲击冰冻的花粉粒，可将花粉粒的外壁剥光，这一处理要控制在50s内完成。
停机后，取出花粉粒用25℃的10%蔗糖溶液解冻，经镜检约有30%～60%的花粉粒被剥去外壁。其剥壁率因不同植物而异，一些具半覆盖层的花粉(如油菜、丝瓜)和无覆盖层的花粉(如芝麻、油桐)剥离率可高达60%～70%；具全覆盖层外壁的花粉(如玉米、小麦、棉花)剥离率偏低，约30%～50%。
再用酶液消化内壁(酶液包括2%纤维素酶、2%果胶酶、0．5%葡萄糖硫酸钾)，在25℃暗室中酶解1h可消化内壁，用染色法(用氯化三苯基本氮唑，TTC)作初步的花粉原生质体活性测定，有一定的成活率。
花粉原生质体的成活率与加高电压处理的条件有密切的关系，电压越高，处理的时间越长，其成活率越低。
实验证明，以6000V电压维持5min，基本上不能存活，以3000V40～50min为宜。在这种剥离方式中，用上述酶溶液预酶解新鲜花粉1h后，再作冰冻剥离处理，可大幅度地提高花粉剥离率。(2)用插入式探头的超声波剥离花粉壁，类似细胞破碎机原理。将鲜花粉用上述酶液酶解1h后，放入特制的可以用冰水混合液冷却的杯中，再以插入式探头的超声波作剥壁处理。杯需用导热良好的材料(如合金铝或黄铜)制作，杯的结构是：中央有一个小杯用以盛冰水混合液，其外围形成一道环形槽用以盛酶液和花粉混合液，该槽的外围又是一道环形槽用以盛冰水混合液，当超声波探头插入花粉混合酶液震荡时迅速升温，其热量可从内外两个方面被吸收以保护花粉活性。
超声波的输出功率最好能调至250W，频率调至20万Hz以上，处理20min左右，中间暂停2～3次，作间歇处理，以便严格控制花粉混合液升温(控制在35℃以下)，有利于提高花粉原生质体成活率。实验证明，这种方法比前一种方法好。花粉剥离率虽然也因不同植物而异，但一般都能达到80%，成活率也明显提高，其成活率与处理时使用的超声波频率和功率有密切关系。
实验证明这两种方案都是可行的，但都不太稳定，在许多方面尚须改进，其难点在于既要提高花粉壁剥离率又要尽可能提高花粉原生质体的成活率，在仪器使用参数方面和剥壁处理条件方面都需要围绕这一问题进行实验研究。
基于花粉原生质体在植物生物学、细胞工程、遗传操作等研究方面的重要用途，如何除掉花粉外壁障碍的研究在今后一段时期内将是一个热门课题，可能从以下几条途径突破这一难题。
(1)继续寻找新的生物酶类，尤其要寻找一种能完全消化组成花粉外壁孢粉素的酶，这条途径对于保证分离得到的花粉原生质体的活性将是十分有利的。(2)采用电技术，例如高压脉冲电产生冲击离子的技术，加上酶液分解综合作用，也不失为一种可能的途径，但这种方式可能要牺牲一部分花粉原生质体的活性。(3)采用超声波之类的机械振动原理加之酶解的综合作用除去外壁，这是很有前途的方法，问题在于要通过大量实验寻求最佳振频和振幅，并创造最佳的散热条件，把花粉壁离率和花粉原生质体成活率兼顾到理想的程度。
。【参考文献】：1 Power J B. Plant Tissue and Cell Culture Oxford: Blackw-ell, 1973.118～119
2 Bajai Y P S,Davey M R. Fertilization in Higher Plants Amsterdam. 1974,73～80
3 Southworth D. Amer J Bot. , 1974,36～44
4 Baiai Y P S. Rev Cytol. , 1983,16 :113～141
5 Loewus F A, et al. plant physiol. , 1985,78:652～654
6 朱徽，王镨，胡适宜．实验生物学报，1985，18：135～141
7 兰盛银，徐珍秀．华中农业大学学报，1986，5(1)：1～6
8 Lan Shengyin．Proc，XIth Int Cong On Electron Microscopy．1986，8：3263～3264
(华中农业大学兰盛银撰)