染色方法

出处：按学科分类—医药、卫生 科学普及出版社《麻风病实验室工作手册》第49页（2330字）

ML染色方法的种类很多。仅抗酸染色法就有十几种。临床查菌多年来应用的是Z-N氏抗酸染色法。

一、染色液配制

1．石碳酸碱性复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石碳酸溶液90毫升混合即成。

复红酒精饱和含液及配好的复红染液，均应盛于棕色玻瓶内置冷暗处存放。存放日久易生沉淀，此时可水浴加温溶解，过滤后使用。石碳酸蒸气易燃，配制时需加注意。

2．1%盐酸酒精：取浓盐酸1毫升，70%酒精99毫升混合。

3．吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰(又名亚甲兰，次甲基兰)2克，溶于95%酒精100毫升内，制成酒精饱和液。取此饱和液30毫升，加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0．1毫升即成。此染液配妥后置棕色玻瓶内冷暗处存放。

二、染色步骤

1．涂片加热固定。在酒精灯火焰上通过3～4次，以不烫手为度，切勿过热(如不能确定涂片是否已固定，应再加热固定)。

2．滴加石碳酸碱性复红液于玻片上，用玻片夹挟持涂片以微火加温使生蒸汽，保持5～10分钟，应防止染液沸腾或干涸。有人使用不加热染色法(即所谓冷法染色)也能取得良好的染色结果，但染色时间应稍长，一般以10－20分钟为宜。待冷后，用水轻轻冲洗，倾去涂片上的水。

3．用1%盐酸酒精液脱色10～30秒钟，以涂膜呈极淡红色为宜。用水轻轻冲洗完全冲去脱色剂，然后倾去涂片上的水。

4．滴加美兰液复染半分钟～1分钟，水洗，自然凉干，备检。

三、结果

ML染成红色，其它细菌(非抗酸菌)及细胞均染成蓝色。

四、注意事项

1．制作涂片用的载玻片一定要妥为清洗。确保清洁无油脂，否则滴加石碳酸复红染液后，染液易流动，不能集中在涂膜上。这样很易使涂膜上的染液干涸，使复红残渣难以脱去，造成镜检时的困难。

2．涂片染色前要仔细辨认涂膜面，勿误使涂膜面朝下。当涂膜较薄时易发生这种现象，应加注意。

3．勿用染色缸染色，以防涂片上的ML掉进染液，而造成其它涂片的假阳性。

4．每次染色的涂片不宜过多，一般5张左右涂片为宜。过多时照顾不过来，容易影响染色质量。

5．脱色步骤很重要。ML抗酸性比结核杆菌弱，较易脱色，因此，不要脱色过度。如有个别涂膜难以脱色，可个别处理，但应注意脱色时间不要过长，以免因脱色过度而造成假阴性。水冲时水流宜轻缓，但要冲洗充分。

6．染片宜自然晾干或加温使干，而不宜使用吸水纸。使用吸水纸时有可能沾去涂膜内的ML，也有可能在涂片染色过程中传递细菌。

7．涂片如不能立即染色，应固定后置标本盒内保存，保存时间一般不宜超过10天。染片应及时镜检，如不能及时镜检，应置于标本盒内妥为存放，但时，间不宜过长，以免细菌脱色。

8．染片镜检毕，脱油后置标本盒内保存，备监督复查。一般须保存三个月。由于存放时间较长，细菌可能脱色，复查时可再行染色。同时应特别注意避光、防霉、防尘。

9．宜用优质碱性复红染料。染料存储年限过长，容易变质，应予注意。配好的复红染液要经常检查，如有沉淀须加热溶解过滤后使用或重新配制。

10．力求每次染色步骤前后一致。同室人员要统一染色操作规程，人人严格遵守。

注：

1、近年来有人推荐原田(Harada)氏染色法，用以提高ML的检出率，但目前尚未广泛采用。原田氏法，即涂片经固定后，用10%过碘酸(称取10克过碘酸，溶于100毫升蒸馏水内)室温浸泡2小时。然后按照Z-N法染色。经原田氏染色后，ML着色较Z-N法染色者为深，细菌指数及形态指数也多高于Z－N法染色的结果。

2、荧光素染色法：涂片固定后，用0．1%金胺O(即金丝雀黄。用5%石碳酸液配制)染5分钟，水洗；3%盐酸酒精脱色1分钟，水洗；0．1%高锰酸钾冲洗，立即倾去，再用1%美兰复染半分钟，水洗；空气干燥后用荧光显微镜检查，凡发金黄色荧光、边缘整齐、形态完整的杆状菌即为ML，应注意与非特异的荧光物质鉴别。

荧光显微镜检查ML阳性率较高，但菌的形态不易观察，易与其他发荧光的物质相混淆而致成假阳性，且需特殊设备，目前临床上应用还不广泛。