叶酸的测定方法

出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第263页（10223字）

化学名：N－〔4－[(2－氨基－1，4－二氢－4－氧代－6－蝶啶)甲氨基]苯甲酰基〕－L－谷氨酸(N〔4－[(2－Amino－1，4－dihydro－4－oxo－6－pteridinyl)methyl amino]benzoyl－L－glutamic Acid

结构式：

分子式：C₁₉H₁₉N₇O₆

相对分子质量：441．40

一、叶酸的鉴别

1．试剂和溶液

0．1mol／LNaOH溶液。

2．仪器

紫外分光光度计，附1cm比色池。

3．操作步骤

取样品，加氢氧化钠溶液制成10μg／mL的样品溶液，用紫外分光光度计测定，在波长(256±2)nm，(283±2)nm，(365±4)nm处有最大吸收峰，吸光度256nm与吸光度365nm的比值应为2．8～3．0。

二、叶酸含量测定

(一)比色分光法

1．试剂和溶液

1．1 0．1mol／L NaOH溶液。

1．2 2mol／L HCl溶液。

1．3 锌粉(无砷锌)。

1．4 亚硝酸钠 0．1%溶液。

1．5 氨基磺酸铵 0．5%溶液。

1．6 二盐酸萘基乙二胺 0．1%溶液。

1．7 对照品溶液的制备 称取叶酸对照品(同时测定水分)0．08g(准确至0．0002g)，置100mL量瓶中，加氢氧化钠溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀(溶液A)。精密吸取溶液A2mL，置另一100mL量瓶中，加盐酸溶液20mL，用水稀释至刻度，摇匀，即得。含叶酸对照品约16μg／mL(溶液B)。

1．8 样品溶液的制备 称取叶酸样品，按对照品溶液的制备法制备，即得。

2．仪器

分光光度计，附1cm比色池。

3．测定方法

精密量取对照样品B与样品溶液B各60mL，分别置250mL具塞锥形瓶中，各加锌粉0．5g(可稍过量)，连续振摇20min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，各精密吸取滤液2mL，分别置10mL量瓶中，依次加水3mL，盐酸溶液1mL与亚硝酸钠1mL，混匀，放置2min，各加氨基磺酸铵溶液1mL，混匀，放置10min，各加二盐酸萘基乙二胺溶液1mL，混匀，放置10min，用水稀释至刻度，摇匀。

另精密吸取对照溶液A与样品溶液A各20mL，分别置100mL量瓶中，各加盐酸溶液20mL，用水稀释至刻度，摇匀。各精密吸取2mL，分别置于10mL量瓶中，以下按上述自“依次加水3mL……”起依法操作。

另取水2mL置10mL量瓶中，以下按上述自“依次加水3mL……”起依法操作，作为空白，用分光光度计测定，以1cm比色池在波长(550±1)nm处测定上述二组溶液的吸光度。

4．操作步骤

叶酸含量(以质量分数表示)按式(9－57)计算：

式中 A₁——用锌粉还原的对照品溶液吸收度

A₂——用锌粉还原的样品溶液吸收度

A₃——未用锌粉还原的对照品溶液吸收度

A₄——未用锌粉还原的样品溶液吸收度

m₁——对照品质量，g

m₂——样品质量，g

w₂——对照品水分含量，%

w₃——样品水分含量，%

5．允许差

两次平行试验的相对偏差应小于2%。

(二)高效液相色谱法

1．试剂和溶液

1．1 磷酸二氢钾。

1．2 0．1mol／LKOH溶液。

1．3 甲醇(HPLC色谱级)。

1．4 烟酰胺(药用级)。

1．5 氨水0．5%溶液。

1．6 叶酸对照品(中国卫生部生物制品鉴定所)。

2．仪器

高效液相色谱仪，附十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

3．系统适用性试验

以磷酸二氢钾6．8g与0．1mol／LKOH溶液70mL，加水稀释成约850mL，并调节pH至6．3±0．1，加甲醇80mL，用水稀释成1000mL的溶液为流动相；检测波长为254nm，叶酸峰和内标物质峰的分离度应大于1．5。

分离度(R)按式(9－58)计算：

式中 tR₂——叶酸峰的保留时间

tR₁——烟酰胺峰的保留时间

w₁——叶酸峰的宽度

w₂——烟酰胺峰的宽度

4．校正因子测定

取烟酰胺适量，加水溶解并稀释至1mL中含1．0mg的溶液作为内标溶液；另称取叶酸对照品5mg(精确至0．00002g)置25mL量瓶中，加0．5%氨溶液约15mL溶解，精密加入内标溶液5mL，用同一溶剂稀释至刻度，摇匀，取10μL注入液相色谱仪，计算校正因子。

校正因子(F₁)按式(9－59)计算：

式中 A₅——烟酰胺的峰面积

A₆——叶酸对照品的峰面积

m₃——烟酰胺的质量，g

m₄——叶酸对照品的质量，g

5．供试品溶液的制备与测定

取本品约5mg(精确至0．00002g)，按式(9－60)校正因子测定项下的叶酸对照品溶液的制备和测定。

6．分析结果的表述

叶酸含量x₄(以质量百分数表示)按式(9－60)计算：

式中 F₁——校正因子

A₇——叶酸峰面积

A₈——烟酰胺峰面积

m₅——样品的质量，g

m₆——烟酰胺质量，g

7．允许差

两次平行试验的相对偏差应小于2%。

三、食品中叶酸的测定

(一)高效液相色谱法(本法适于强化叶酸的婴幼儿奶粉)

1．原理

叶酸经超声抽提后调pH至4．5沉淀蛋白质，用高速离心除去脂肪和蛋白质，清液经CGS树脂柱，除去大部分杂质，随后用pH8的磷酸盐缓冲液洗脱，调pH至7后，定容，以0．22μm滤膜过滤，进HPLC，用ODSC₁₈反相柱，紫外检测器，波长285nm，流动相0．05mol／L磷酸氢二钾+甲醇为91∶9。

2．试剂和溶液

2．1 0．05mol／LK₂HPO₄溶液，pH7。

2．2 叶酸标准母液 精确称取叶酸5mg，溶于0．05mol／LK₂HP0₄溶液(pH7)中，加25mg维生素C，定容于25mL棕色容量瓶中。

2．3 叶酸标准工作液 精确吸取0．05mL叶酸标准母液至10mL容量瓶，并加入1．118g氯化钾及10mg维生素C，以pH7．00．05mol／LK₂HPO₄溶液溶解，调至pH7定容。

2．4 0．0lmol／LK₂HPO₄溶液，pH4．0。

2．5 O．05mol／LK₂HPO₄溶液，pH4．5。

2．6 甲醇 过0．5μm膜。

2．7 CGS树脂 100～120目。

2．8 1．5mol／LKCl—0．05mol／L K₂HPO₄pH8洗脱液 称224g氯化钾及22．82g磷酸氢二钾，以去离子水溶解，定容至2L，调节pH至8．0。

3．仪器

3．1 超声处理机。

3．2 超速离心机 15000r／min。

3．3 高效液相色谱仪。

4．测定方法

叶酸对热、光不稳定，操作时应避光。

4．1 抽提 称取3g强化奶粉，加50mg维生素C，以0．05mol／L K₂HP0₄溶液(pH7)调节匀，超声处理10min，调节pH至4．5移入50mL容量瓶，定容，于5℃，15000r／mim离心20min，取清液10．00mL，调节pH至4．0。

4．2 离子交换层析 用250mm×5mm玻璃层析柱，填装CGS树脂8cm，以40mL沸腾去离子水洗柱，并用pH4．0，0．01mol／L K₂HPO₄缓冲液过柱后，将pH4，10mL样液进柱，速度为1mL／min，随后用3×0．5mLpH4的缓冲液洗柱，前后用40℃pH81．5mol／LKCl0．05mol／LK₂HPO₄缓冲液洗脱，收集洗脱液约9．8mL，收集液用氢氧化钾调节pH至7，定容至10mL，用0．22μm滤膜针筒过滤器过滤。

4．3 HPLC测定。

4．3．1 色谱条件如下：

色谱柱：300mm×3．9mm，反相ODS C₁₈；10μm预柱50mm

流动相：pH7．0，0．05mol／L K₂HPO₄+甲醇=91+9

检测器：紫外，波长285nm

灵敏度：0．005

流量：1mL／min

柱温：30℃

压力：9．8MPa

4．3．2 测定：取处理好的样液，进样100μL，采用外标法峰高测定，各作3次取平均值。

5．分析结果的表述

式中 h——样品中叶酸平均峰高

h₀——外标叶酸平均峰高

ρ₀——外标叶酸进样液浓度，μg／mL

V₀——外标叶酸进样量，mL

m——样品质量，g

V——样品进样量，mL

(二)微生物法

1．原理

样品溶于水，加稀氨液在121℃、15min除去溶于水的固形物，调pH，利用粪链球菌对叶酸的专一性，在一定条件下，经过培养后测透光度，与标准工作液对照，计算含量。本法适用于含游离态叶酸的含量。

2．试剂和溶液

2．1 天冬氨酸溶液 8gL－天冬氨酸水合物加800mL水溶解，加1滴甲苯保存。

2．2 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 各取0．5g硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶，加25mL(1→2)盐酸溶液，在水浴中加热溶解，冷后加水成500mL，加1滴甲苯，置冷处保存。

2．3 尿嘧啶、盐酸鸟嘌呤、硫酸腺嘌呤、黄嘌呤 均为特级。

2．4 氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 均为特级。

2．5 25%～28%氨水 特级。

2．6 95%乙醇、甲苯 特级。

2．7 盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、烟酸、泛酸钙 特级。

2．8 盐类溶液A 称取25g磷酸二氢钾和25g磷酸氢二钾，加水溶解成500mL，加5滴盐酸和1滴甲苯后保存。

2．9 盐类溶液B 取20g磷酸镁、1g氯化钠和1g硫酸亚铁及1g硫酸锰，加水溶解成1000mL，再加10滴盐酸及2滴甲苯保存。

2．10 琼脂粉末。

2．11 黄嘌呤溶液 0．4g黄嘌呤加水约80mL混合，在70～80℃水浴中加热并不断振摇混合。加12mL(2→5)氨水，振摇溶解，冷却后加水成400mL，加1滴甲苯放冷处保存。

2．12 菌种保存培养基和保存方法 取15g胨化乳、10g酵母浸膏、10g葡萄糖、2g磷酸二氢钾，加水600mL溶解，然后加100mL番茄汁滤液，用1mol／LNaOH溶液调节pH6．5～6．8，然后加10mL polysorket－80乙醇溶液，加水成1000mL。向此液中加10～15g琼脂粉末，加温溶解，温时分装在预先经干热灭菌并具有棉塞的试管中各10mL，在121℃高压灭菌20min，灭菌后立即冷却凝固。从Lactobacillus Casei ATCC 7469的纯培养基中移殖于菌株保存培养基中。移殖的菌株保存培养基37℃培养16～24h。放冷处保存。

2．13 谷胱甘肽(还原型)溶液 0．125g谷胱甘肽加100mL水溶解。冷冻保存。

2．14 酵母浸膏市售品。

2．15 L－半胱氨酸盐酸盐水合物 特级。

2．16 增菌用培养基 与菌株保存培养基同一组成，不加琼脂，分装在预先塞好棉塞而经干热灭菌(170℃，2h)的试管中各10mL，在121℃高压灭菌10min，灭菌后立即冷却，冷处保存。

2．17 色氨酸溶液 取2gL－色氨酸加700～800mL水成悬浊液，加热70～80℃，边振摇边滴加盐酸，至L－色氨酸结晶溶解，冷却后加水成1000mL，加1滴甲苯，常温下保存。

2．18 对氨基苯甲酸 特级。

2．19 维生素溶液 取20mg对氨基苯甲酸、40mg盐酸吡哆醇、4mg盐酸硫胺、8mg泛酸钙、8mg烟酸及20mL(1→100000)D－生物素，溶于约300mL水中。另取10mg核黄素溶于200mL(3→2500)乙醇溶液，加入上述溶液中，再加1．9g无水硫酸钠及1．6mL乙酸，加水成40mL的溶液，最后加水成2000mL，加1滴甲苯避光冷处保存。

2．20 D－生物素 维生素H。

2．21 Casamino酸 不含维生素的酪蛋白氨基酸。

2．22 葡萄糖。

2．23 胨化乳 市售品。

2．24 聚山梨酸酯－80乙醇溶液 20g聚山梨酸酯－80加乙醇溶液成100mL。

2．25 无水乙酸钠 特级。

2．26 灭菌生理盐水 9g氯化钠溶于1000mL水中，分装于预先塞好棉塞并经干热灭菌的试管中，每管10mL。在121℃高压灭菌20min。

2．27 核黄酸 优级纯。

3．仪器

3．1 实验室常规用具。

3．2 分光光度计。

4．测定

4．1 样品溶液的制备 一般准确称取相当叶酸约1μg的样品10g以下，加100mL水，2mL(2→5)氨水，充分搅拌混合，盖好棉塞，在121℃高压灭菌器中灭菌15min，冷却，用过滤和离心分离方法获得澄清的提取液。再用70～80mL水定量收集分离液或滤液，用0．1～1mol／LNaOH溶液调节pH6．8，然后加水准确成200mL，取此液20mL，加水准确成100mL，作为样品溶液。

4．2 标准液的制备 准确称取10mg叶酸，放入500mL容量瓶中，加入约30mL(0．01mol／L)NaOH溶液溶解，加水约300mL，再加(1→120)盐酸溶液调节pH至7～8，加水定容至500mL，为标准原液，含叶酸20μg／mL。加1滴甲苯，置冷暗处保存。

取5mL标准原液加水成1000mL，再取此液10mL加水成1000mL，作为标准液，含叶酸1ng／mL。

4．3 定量用培养基的制备 取2．5g不含维生素的Casamino酸，15mL天冬氨酸溶液，12．5mL色氨酸溶液，2．5mL腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液，50mL维生素溶液，5mL盐类溶液B，0．125gL－半胱氨酸盐酸盐水合物，10g葡萄糖，10g无水乙酸钠，5mL黄嘌呤溶液，放入300mL三角烧瓶中，充分混匀溶解，用0．1～1mol／LHCl溶液或0．1～1mol／LNaOH溶液调节pH为6．8。然后加0．25mL聚山梨醇酯－80乙醇溶液，在沸水浴中加热5min后，于冷水中冷却，加1mL谷胱甘肽溶液，充分混合后过滤，滤液加水成250mL，作为定容用培养基。

4．4 接种菌液的制备 用Lactobacillus Casei ATCC 7469作为使用菌株。将菌株保存培养基保存的菌株移殖到增菌培养基中，在37℃培养16～24h。取5mL培养液在无菌条件下用离心方法分离增殖的菌体，用灭菌生理盐水洗3次。其浓度用分光光度计以灭菌生理盐水为参比，在波长550nm处测定透光率。菌液用灭菌生理盐水稀释至透光率为75%～85%作为接种菌液。

4．5 测定方法。

4．5．1 接种和培养：准确吸取标准液0．0，0．5mL，1．0mL，1．5mL，2．0mL，2．5mL，3．0mL，4．0mL，5．0mL各两份，分别放入两系列试管S_A(0～5)、S_B(0～5)中。另取样品溶液1．5mL、2mL、2．5mL、3mL、4mL各两份，分别放入另外两系列试管T_A(1．5～4)、T_B(1．5～4)中。向所有试管中加水准确成5mL，另取二支试管，加5mL水作为对照管。向各管中准确加入5mL培养基，盖好铭制帽，120℃高压灭菌5min。冷后，除对照管外，无菌地各接种1滴接种菌液，把全部试管(包括对照管)于(37±0．5)℃培养16～24h。培养后立即放入高压灭菌器中，115℃高压灭菌5min，作为培养液。

4．5．2 测定：用分光光度计，以1cm比色杯，在波长550nm下，以对照液为参比，测定各试管中培养液的透光率。

4．5．3 定量：求出相对应的标准液透光率S_a00和S_b00，S_a01和S_b05……S_a5和S_b5的各平均值，绘制标准曲线。再求出相对应的样品溶液的透光率Ta和Tb的各对平均值，分别在标准曲线中求出各管中叶酸含量(ng／mL)，再计算出1mL样品溶液的含量。这些数值的平均值为ρ(ng／mL)，根据式(9－54)计算出样品中的叶酸含量(μg／100g)。如果标准液或样品溶液中某个管的吸光度值在系列浓度中偏差超过±10%时，此数值应舍去。如果在10支样品溶液管中有6支以上的透光率被弃去，则应重做。

5．分析结果的表述

式中 m——取样量，g

ρ——样品溶液中的平均叶酸浓度，ng／mL