空斑形成试验

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第571页（3039字）

病毒接种于易感的单层细胞培养，再加一层琼脂将细胞覆盖。这样病毒自感染细胞释出后只能感染周围与其接触的细胞，以致感染区由原始病灶逐渐扩大，形成类似固体培养基上的细菌菌落，称为空斑或蚀斑(plaque)。这个名称来源于噬菌体在菌苔上裂解细菌而形成的病变。如果在琼脂中加入中性红等活性染料，则可看到活细胞呈红色，病毒感染区呈灰白色。形成一个空斑的病毒量称为一个空斑形成单位(PFU)。一个待检样品中病毒的PFU数可根据空斑数乘上接种剂量和稀释度测出。为了结果准确，应将病毒稀释到每一接种剂量含10～300PFU。每一稀释度接种3个细胞单层，取其平均值计算，这样误差可以控制在17%以内。例如空斑数平均为66个，接种剂量为0．2ml，病毒稀释度为3×10^-4，则每ml中的PFU为：

66÷0．2×1／3×10⁴=1．1×10⁶

一、空斑形成试验

有单层细胞法和悬浮细胞法两种，前者应用最广，叙述如下。

1．在细胞培养扁瓶中使细胞长成致密而无空隙的单层。接种的细胞浓度因细胞种类不同而差异很大，例如鸡胚成纤维细胞可达250～300万／ml，HeLa等传代细胞则可减少到50万／ml。细胞培养容器也可用培养皿，但培养时须放在密闭容器内或者CO₂培养箱内。

2．接种前在倒置显微镜下检查细胞生长是否正常，单层是否长满。

3．将营养液倾去，用新营养液将细胞单层轻洗一次。将营养液彻底吸去，接种含10～300个PFU的病毒液。病毒浓度要大一些，即接种量要小一些，使病毒容易吸附于细胞。也可根据TCID50来稀释病毒，在接近终点稀释度时应作2倍量或3倍量稀释，以免病毒浓度过大或过小。一般接种量为0．1ml／10～15cm²。病毒液要滴在培养瓶的中央，每一稀释度接种三瓶。

4．用手将瓶旋转，使病毒液分布均匀，然后将瓶放置水平，在37℃培养60min使病毒充分吸附于细胞。为了避免病毒液分布不匀，可每隔10min将培养瓶取出用手重新旋转。

5．将培养瓶放在水平的桌上(冬季最好放在37℃的水浴箱盖上)，立即加入融化后冷却到43～45℃的琼脂覆盖层。覆盖层的厚度约2～3mm。

6．琼脂覆盖层的组成如下。

2．25%高级琼脂(或琼脂糖) 40ml

2倍浓缩的Eagle氏MEM液 50ml

犊牛血清 5ml

1∶1000中性红 3ml

青霉素(10000IU／ml) 1ml

链霉素(10000μg／ml) 1ml

用7%NaHCO₃将pH调到7．2～7．4

7．凝固后将瓶倒置，在37℃培养。

8．每天观察。空斑一般淡白色，背景淡红色。有些病毒可形成红色空斑，即空斑颜色或空斑边缘的颜色比背景更红。

注意事项如下。

1．覆盖层中的琼脂先用100℃水浴融化，在水浴中冷却到45℃。将营养液、犊牛血清、抗生素也在45℃水浴中约30分钟，使达到相同温度，以免加入时使琼脂凝固。将上述各种成分混在一起，用NaHCO₃调整pH。NaHCO₃加入后在45℃不能保留超过30min，否则CO₂逃逸太多，影响pH和培养效果。

2．只要细胞不衰老，培养时间尽量长些，使空斑充分发育。

3．中性红常对病毒有毒性，特别是质量差和保存过久的产品。因此可不直接加入琼脂覆盖层中，而在检查前临时加入。每培养瓶加入1∶20000的中性红2ml，在37℃培养2h后观察。也可将中性红加于营养琼脂(浓度为90ml凝胶加1∶1000中性红10ml)中作第二覆盖层用。即在第一覆盖层加入后培养3～4天再加第二覆盖层，用量约为第一覆盖层的1／3。也可用台盼蓝(只染死细胞)代替中性红。

4．中性红是荧光染料，在可见光下对病毒产生毒害作用，从而影响空斑的正常发育。因此培养应在暗处，观察时光线不能强，时间不能久。中性红溶液要现配现用，或者在暗处作短期保存。灭菌最好用过滤法，如必须用高压蒸气灭菌，不宜超过110℃。

5．琼脂中常含有硫酸多糖，对病毒有毒害作用，必须经过充分净化。目前有售细菌学用高级琼脂可不必经此步骤。此外尚可应用琼脂糖，青岛水产所生产的4号琼胶素(即琼脂糖)效果很好。有人喜欢用甲基纤维素，此物在4℃时为液体，在37℃时为固体，加于营养液中作为覆盖层甚为方便。

6．DEAE葡萄糖(200μg／ml)能克服琼脂中硫酸多糖的有害作用，促进某些病毒的空斑形成。Mg离子(MgCl₂或MgSO₄20～30mmol／L)能促进某些病毒的吸附，有利于空斑的发育。例如NDV弱毒株的空斑试验，在覆盖层中必须含有上述两种化合物。

7．HgCl₂能使中性红在细胞中沉淀，用它处理后红色可以久留不褪。

8．病毒接种量太多会造成空斑互相融合而影响计数，接种量太少准确性也差。在30cm²的培养瓶中空斑数不超过100个时一般不会发生严重的融合，但空斑直径必须在3mm以下，否则接种量还应减少。

二、空斑抑制试验

此法用以检测待检血清或抗血清中的抗体滴度，也可检测干扰素等化合物的抗病毒作用。

1．待检血清作连续倍比稀释。

2．各稀释度分别与等量病毒液(含100PFU)混合，在37℃作用1～2h。

3．接种细胞单层，作空斑计数。

4．能使空斑数减少50%的血清稀释度即为该血清的滴度。

干扰素的空斑减数测定与此略有不同，参见干扰素测定一节。

另有一种简易试验用以定性测定抑制病毒的效果。此法与抗生素敏感试验相似，即以灭菌滤纸片浸入待检血清中，然后取出贴在接种病毒的琼脂覆盖层上，培养后观察空斑抑制圈的范围。