凝集反应
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第146页（12661字）
颗粒状态抗原(凝集原)与相应抗体(凝集素)结合后，在有电解质存在时，凝集原相互凝集成丛，称为凝集反应。参与反应的凝集素主要是IgG和IgM，凝集原通常为光滑型的细菌或动物红细胞。本法简易快速，有高度特异性，广泛应用于细菌的血清学鉴定、慢性细菌性传染病的检疫和血型检查。将可溶性抗原吸附于某均质的载体颗粒，即可用作凝集原进行凝集反应，称为间接凝集或称被动凝集，已广泛应用于可溶性抗原抗体系统的检测，在病毒病诊断中尤为常用。
一、凝集试验
有平板凝集和试管凝集二种，以布氏杆菌病检疫为例说明如下。
(一)平板凝集试验 在牧区大量家畜布病普查检疫时常用本法代替试管凝集试验。
1．试验方法
(1)取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格，并注明待检血清号码，每一血清用4格。
(2)用0．2ml吸管吸血清，按0．08ml，0．04ml、0．02ml和0．01ml顺序加4小格内，每一检样需换一支吸管。
(3)每格加布氏杆菌平板凝集抗原0．03ml，用牙签混匀，每份血清用一根牙签，从血清量少的到血清量多的逐格混匀。
(4)混合完毕，将玻板置凝集反应箱上均匀加温到不超过37℃，3～5min内记录结果。
(5)每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。
2．结果判定
(1)按下列标准记录反应强度
++++：出现大的凝集块，液体完全透明。
+++：有明显凝集颗粒，液体几乎完全透明，即75%凝集。
++：有可见凝集颗粒，液体不甚透明。即50%凝集。
十：液体浑浊，有少量凝集颗粒，25%凝集。
一：液体均匀浑浊。
(2)以++以上凝集判为阳性，记录各血清量的结果。
(3)样品阳性判定标准同试管凝集试验，平板凝集与试管凝集的对应关系如下：
平板凝集 0．08 0．04 0．02 0．01
试管凝集 1∶25 1∶50 1∶100 1∶200
3．注意事项
(1)待检血清采样要求同试管凝集试验。
(2)大规模检疫时，可只用2个血清量，猪、羊为0．08和0．04，牛、马和骆驼为0．04、0．02，任何一个血清量凝集时，均需用4个血清量重检。
(3)吸管数量不足时，用后在3个盛生理盐水500ml的杯中清洗6次以上，尖端用滤纸吸干后再用。杯中生理盐水在使用20～30次后，即需更换。
(二)试管凝集试验 用作本试验的待检血清必须是新鲜的，采得后于24h内送实验室，最迟不得超过3天，不能按期送达者，需加石炭酸防腐，每0．9ml血清加5%石炭酸0．1ml，立即振荡混合，血清应无明显蛋凝块，无严重溶血和腐败气味。
1．试验方法
(1)待检血清稀释度，牛、马、骆驼为1∶50、1∶100、1∶200、1∶400；山羊、绵羊、猪和狗为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200等4个稀释度。
(2)每份血清用4支试管(1×8cm)，按表加入0．5%石炭酸生理盐水，然后用1ml吸管吸取待检血清0．2ml，加入第一管中，吹吸3次后，吸出1．5ml弃去，再吸0．5ml于第2管，依次吹吸混和至第4管，混和后弃去0．5ml，各管的血清稀释度依次为1∶12．5、1∶25、1∶50和1∶100，各管液量均为0．5ml，用于牛、马和骆驼时，第一管用2．4ml盐水加0．1ml血清，各管稀释依次递增一倍，最后每管留下的稀释血清仍为0．5ml。
(3)各管加入用0．5%石炭酸生理盐水20倍稀释的布氏杆菌凝集抗原0．5ml，每次试验须设抗原对照、阳性血清和阴性血清对照，按下表加入各种成分。
表9-1 布氏杆菌试管凝集试验术式(羊、猪)
(4)加毕抗原后，充分摇匀，置37℃温箱4～10h，再移置室温18～24h(总计28h)，此各管的血清稀释度分别为1∶25、1∶50、1∶100和1∶200。
2．结果判定
(1)按下述标准记录各管凝集程度
++++：液体完全透明，菌体完全凝集呈伞状沉于管底，振摇时，沉淀物呈片状和絮状。
+++：液体略呈混浊，菌体大部沉降于管底，呈伞状，为75%凝集。
++：液体不甚透明，有明显的颗粒状凝集，为50%凝集。
+：液体不透明，有少量颗粒状沉淀，为25%凝集。
一：液体不透明，管底无颗粒状沉淀，不凝集。有时有少量菌体集中于管底中心，但振摇时立即散开呈均匀浑浊。
(2)出现++以上凝集的血清最高稀释度即为该血清的凝集价。
(3)牛、马和骆驼凝集价1∶100以上，猪、羊凝集价1∶50以上判定阳性；牛、马、骆驼1∶50，猪、羊1∶25为可疑。
(4)如对照管不符合要求时，试验废弃重做。
3．注意事项
(1)结果为可疑的家畜，必须经2～3周后采血重检，阳性场(畜群)进行检疫净化时，重检仍为可疑，则应判为阳性。同群中又无具有临床症状和阳性反应的同种家畜时，马、猪重检仍为可疑，可判为阴性；牛、羊血清重检仍为可疑时，可认为阳性，或辅以补反等核对。
(2)对已净化的阴性场(畜群)，初检可疑，重检效价不升高者，为慎重起见可再作补体结合试验及细菌分离培养，以证实之。补反和细菌检查均为阴性者，判为阴性。
(3)将化验结果通知畜主时，必须注明凝集价。
二、间接凝集试验
将可溶性抗原吸附或交联于与免疫无关的小颗粒(载体)表面，此吸附抗原的载体颗粒与相应的抗体结合，在有电解质存在时，即可发生凝集反应，谓之间接凝集反应。反之，亦可将抗体吸附于载体颗粒与抗原作凝集试验称为反向间接凝集。间接凝集可被对应的抗原或抗体所抑制，称为间接凝集抑制试验。间接凝集视载体不同而有间接血凝、乳胶凝集、炭凝集和协同凝集等。
(一)间接血凝试验 红细胞匀质性好，其表面几乎能吸附任何抗原，是一种理想的载体颗粒，利用红细胞作载体进行间接血凝，因其简易快速、特异性高，已广泛应用于血清学诊断的各个方面。
本试验的技术关键是致敏红细胞(吸附抗原或抗体的红细胞)的制备，早期采用新鲜红细胞致敏，因其不易保存现多改用醛化红细胞。醛化后的红细胞呈咖啡色，在4℃冰箱可保存半年以上，还可制成冻干制剂可耐长期保存。
红细胞的醛化剂最常用的是甲醛，亦可应用戊二醛、丙酮醛等，或任选二种醛制备双醛化红细胞，双醛化红细胞可用以致敏各种蛋白质抗原和多糖、脂多糖抗原。用某些蛋白质抗原致敏单醛化红细胞时，需进一步鞣化或用氯化铬等重金属离子处理，以提高其敏感性。
各种抗原视其理化特性不同，均需事先测定其最适致敏条件，包括抗原浓度、pH、温度和致敏时间等。制备标准化的致敏红细胞，消除批间差异有一定的难度，对很多病已有商品化致敏红细胞，如猪瘟、口蹄疫、猪水泡病、伊氏锥虫和弓形体等。一般实验室可向有关单位购买。
下以伊氏锥虫为例。
1．材料准备
(1)器材 96孔V型或U型微量反应板、大孔U型反应板、微型混合器、稀释用标准滴管(每滴0．05ml)、或稀释棒、橡皮吸球、1ml吸管、微型混合器等。
(2)稀释液 0．01MpH7．2磷酸缓冲盐水(PBS)按常规方法配制。
(3)致敏红细胞 用伊氏锥虫裂解抗原致敏鞣酸处理的醛化绵羊红细胞制成，在4～10℃冰箱保存，有效期为一年。另以未致敏醛化红细胞作对照用。
(4)待检血清 按常规方法采集、编号、送检。在大规模检疫时，可采取干燥血纸法。自耳静刺血，用宽1cm的滤纸吸取血液，阴干后编号、送检。干燥血纸在10℃以下干燥器中保存，一年内效价不降。
2．试验方法(干燥血纸法)
(1)先将大孔反应板按血纸样编号，各孔加PBS0．2ml，取血纸1．2cm2剪碎后，对号放入各孔内，浸泡10min，浸出液相当于1∶20稀释的血清。
(2)取微量反应板，在其长端顺序编号，每一检样用两排，每排8孔，各孔加PBS1滴(1滴为0．025ml，下同)。
(3)取待检样的浸出液1滴于第1孔内(1∶40稀释)，混合后，自左至右依次倍比稀释至第7孔，混合后弃去1滴，最后1孔不加检样为空白对照，每一检样按同法稀释二排。
(4)每一检样的第一排孔滴加1%致敏红细胞各1滴，为测定排，第二排滴加1%未致敏红细胞各1滴，为对照排。置微型混合器振荡混合1～2分钟，再在室温放置2小时，待空白对照孔红细胞全部沉于孔底，呈小圆点状时，即可判定结果。
3．结果判定
(1)按下列标准记录各孔血凝反应强度。
++++：为100%凝集，红细胞均匀铺于孔底，呈伞状或荷叶状卷边。
+++：为75%凝集，红细胞均匀铺于孔底，呈毛玻璃状。
++：为50%凝集，孔底中心有少量红细胞沉积，周围有不均匀的分散红细胞。
+：为25%凝集，红细胞大部沉积于孔底中心，周围有少量分散红细胞。
一：为不凝集，红细胞完全沉积于孔底中心，呈小圆点状。
以凝集++以上的最大稀释倍数为该检样的血凝价。
(2)血凝价在1∶80以上，测定排比对照排高两个滴度以上者，判为阳性，只高出一个滴度判为可疑，两排滴度相同判为阴性。
4．注意事项
(1)每次试验时，应作标准阳性血清和标准阴性血清各两排作为对照。
(2)第2排孔出现凝集，表明该血样中含有对绵羊红细胞的血凝素，试前可用未致敏绵羊红细胞充分吸收。但需消耗大量绵羊红细胞，且增加一个步骤，大量检测时很不方便，故多采用两排对比法，以排除非特异性凝集。
(3)操作过程中应尽量避免气泡产生，如孔中有气泡，可用烧热针头烫掉。
(4)红细胞悬液不能冰冻保存，以免出现自凝。用前需充分摇匀，如发现有颗粒状凝块者不能使用。
(5)每一检样用1支滴管，不可交叉使用。
(二)间接血凝抑制试验 间接血凝和反向间接血凝均可被对应的抗原或抗体所抑制。因此一种致敏红细胞既可以用于检测抗体，也可以用于检测抗原。
抗体+抗原致敏红细胞→间接血凝试验(测抗体)。
(抗体十抗原)十抗原致敏红细胞→间接血凝抑制试验(测抗原)。
抗原十抗体致敏红细胞→反向间接血凝(测抗原)。
(抗原十抗体)+抗体致敏红细胞→反向间接血凝抑制试验(测抗体)。
下以口蹄疫反向间接血凝抑制试验为例。
1．材料准备
(1)器材 同间接血凝。
(2)稀释液
吐温磷酸盐缓冲液(TPBS)
NaH2PO4 0．1mol／dm3 115．0ml
Na2HPO4 0．1mol／dm3 385．0ml
NaCl 8．5g
PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 2．5g
Tween-80 0．05ml
NaN3 1．0g
加蒸馏水至1000ml，每100ml加小牛血清0．5ml，置4～8℃冰箱贮存。
(3)标准阳性血清 用已知口蹄疫O型鼠毒和猪水泡病鼠毒分别制备，可向有关单位购买，贮于4℃或-20℃冰箱备用。
(4)标准阴性血清 健猪血清经测试无血凝抑制抗体者。
(5)标准抗原 用口蹄疫(O型)的乳鼠毒，磨成1∶3悬液，置4℃冰箱浸毒24h，3000rpm离心30min，取上清置58℃水浴灭活40min，再用同法离心，吸上清即为抗原，加0．1%叠氮钠，置4℃或-20℃冰箱保存，一般实验室可向有关单位购买。
(6)被检材料 采待测动物静脉血4～5ml，待析出血清后，分装小瓶，分别封盖、编号、送检。
(7)致敏红细胞 取高效价口蹄疫阳性血清(用猪或豚鼠制备)，提取IgG，用以致敏双醛化鞣化绵羊红细胞(致敏时IgG含量为20～40μg／ml、pH6．4)，一般实验室可向有关单位(例如兰州兽医研究所)购买。
2．试验方法
(1)取标准抗原倍比稀释后与致敏红细胞作间接血凝试验。以+++以上凝集的抗原最高稀释倍数为1个血凝单位，将抗原稀释成每滴含4个血凝单位。如血凝价为1∶320，则4个血凝单位为1∶80(1∶320×4)。
(2)被检血清先作1∶5稀释，然后再在微量反应板上，从1∶10开始作倍比稀释，每一检样稀释两排。第11孔不加血清，作为抗原凝集对照。第12孔不加血清和抗原作为空白对照。两排中第1排为测定排，第2排为对照排。阳性血清对照和阴性血清对照按上法作同样稀释。
(3)测定排各加4单位的抗原液1滴，对照排各加稀释液(TPBS)1滴，混匀，置37℃1h取出，每孔加入为口蹄疫抗体致敏的红细胞1滴置微型混合器振荡2min。置室温2h，观察结果。
3．结果判定
(1)记录测定排和对照排各孔的凝集程度，判定标准同间接血凝。
(2)对照排均不凝集，抗原对照呈阳性凝集，空白对照不凝集，测定排出现明显抑制，该血清为口蹄疫阳性血清，出现完全抑制(一)的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价。
(3)如被检血清的抑制价很低，而对照排的对应孔又出现凝集者，判为可疑，应加将该被检血清用醛化红细胞充分吸收后(见血清中的异嗜凝集素的吸收)，重做。
(4)测定排均出现阳性凝集，对照排均不凝集者判为阴性。
4．注意事项
(1)本法只能用于测定O型口蹄疫的抗体，必要时可同时用几个血清型的反向致敏红细胞，以及猪水泡病的反向致敏红细胞进行试验。
(2)亦可用抗原致敏红细胞作间接血凝以检测抗体，其判定标准为1∶40以上凝集判为阳性，1∶20以下为阴性。
(3)此类方法的关键是致敏红细胞，用前应用标准阳性和阴性血清对致敏红细胞进行检查，合格者始得应用。
附：血清中的异嗜凝集素的吸收取被检血清0．1ml，加未致敏的2%醛化红细胞0．9ml，混和后置37℃水浴30min，离心除去红细胞，即为1∶10稀释血清。
(三)乳胶凝集试验 大小一致的聚苯乙烯为球形小颗粒，在偏碱条件下，呈稳定的白色悬浮液——乳胶，乳胶颗粒能吸附多种蛋白质和高分子物质，利用乳胶作载体，以吸附某些抗原或抗体，即可用以检测相应的抗体或抗原，本法具有简易、快速、保存方便、比较正确等优点，已用于钩端螺旋体病、囊虫病、妊娠诊断及沙氏门菌的抗原检测等。下以检测沙门氏菌抗原的乳胶凝集试验为例。
1．材料准备
(1)器材 玻板或玻片、蜡笔和滴管、吸管等。
(2)沙门氏菌诊断血清 沙门氏菌A-F多价血清或各群单价血清。
(3)聚苯乙烯乳胶 有商品出售(如北京天坛生物制品研究所、上海第六人民医院)，亦可自制合成(详见附录)。
(4)硼酸盐缓冲液
甲液 硼酸 12．37g加水至1000ml
乙液 硼砂 19．07g加水至1000ml
二液配好后分别高压灭菌，用时取甲液65ml，加乙液35ml即成，pH8．4～8．6。
(5)乳胶致敏 取乳胶1ml加蒸馏水4ml，硼酸缓冲液20ml，使成25倍稀释乳胶，滴加用生理盐水1∶20稀释的沙门氏菌诊断血清1～2ml，边加边摇，至出现微细颗粒后，仍继续滴加直至颗粒消失为止。对上述致敏乳胶应进行下列检查，符合条件者方可使用。
①与生理盐水不出现自凝。
②与相应抗原的菌株出现阳性凝集。
③与其他无共同抗原的菌株不出现凝集。
2．试验方法
(1)将待检样品(食品、水或其他)接种于沙门氏菌增菌培养基(参见沙门氏菌节)上，37℃培养24h。
(2)取洁净玻板或玻片，用蜡笔划成方格，以防液体溢出。
(3)滴增菌培养物2～3滴于玻板的方格内，记上检样编号。
(4)在其上滴加致敏乳胶1滴，用牙签混和后轻轻摇动。
(5)于3～5min出现明显凝集颗粒者为阳性反应，根据其反应程度以++++、+++、++、+和一记录反应结果。
本法可缩短沙门氏菌检测时间，与常规培养法的符合率达96．6%。
聚苯乙烯乳胶合成方法如下。
1．取蓖麻油50ml加蒸馏水50ml，于调温调速磁力搅拌器上60℃搅拌5min，加NaOH8g和蒸馏水100ml，加热搅拌到80℃，维持约1h，直到完全皂化为止，是为乳化剂。
2．将60ml苯乙烯和20ml15%NaOH一併加入三角瓶内，剧烈摇动5min，静置20min后弃去下层的NaOH溶液，然后用蒸馏水重复以上处理数次，直至苯乙烯变为中性为止。即为纯化的苯乙烯原体。
3．于三角瓶内加蒸馏水250ml，1∶40稀释的乳化剂2ml，加热至60℃，并以150rpm速度连续捣拌。然后加入30ml纯化苯乙烯单体和0．5g过硫酸钾(分析纯)，维持于80～90℃之间继续搅拌1h后，再加入20ml纯化单体和0．5g过硫酸钾，继续维持于80～90℃，并不停搅拌7小时，取样镜检，如不见单体油珠，反应即告完成。
4．取上述合成乳胶2ml，加蒸馏水500ml于1300r／min离心20min，弃沉淀，上清再于1800r／min离心20min，取集沉淀。此沉淀颗粒直径大约0．8μm左右，镜检可见颗粒均匀一致。经选择的乳胶悬液经新华滤纸过滤，加入0．05%叠氮钠，4℃保存待用，保存期可达一年以上。
(四)炭素凝集 活性炭颗粒表面有许多蜂窝状结构，对蛋白质等有很强的吸附力，故可用作间接凝集的载体，其缺点是炭素颗粒的不均质性和不规则形状，影响反应的观察。
下以猪囊虫的炭凝反应为例。
1．材料准备
(1)器材 玻板、蜡笔、吸管、滴管、小手术刀、离心机等。
(2)炭粉 取上海活性炭厂生产的767型针剂炭粉，经105℃干燥4小时，用360目／时标准筛过筛，筛出炭粉保存在37℃恒温箱中备用。
(3)稀释液 0．01MpH7．2，PBS按常规方法配制。
(4)溶剂 在上述PBS中再加硼酸0．5%，牛血清白蛋白(BSA)0．1%和叠氮钠0．1‰。
(5)囊液 用针头抽取新鲜猪囊虫的囊液，经3000rpm离心20min，取上清加0．1‰叠氮钠，保存于1～3℃冰箱备用。
(6)炭粉致敏
①取囊液20ml于三角瓶内，再取溶剂600ml于另一个三角瓶内，二瓶同置56℃水浴内灭活30min。
②称取干燥炭粉4g加入盛囊液的三角瓶内，加入玻璃珠20～30粒，充分摇匀，在37℃水浴致敏10min，然后加入pH7．2PBS60ml，摇匀，继续致敏1h。其间每10min振摇1次。
③经2000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入溶剂5ml，摇匀后在室温静置2h。
④在上述浓液中再加入溶剂200ml，用同法离心洗涤2次。
⑤在沉淀物中加入溶剂80ml，混匀后即为炭粉抗原。
2．试验方法
(1)用小手术刀刺破猪耳静脉(先擦以凡士林)，用吸管吸取血液6滴，于盛有2ml的0．3%柠檬酸钠溶液的小试管中，即成7倍稀释的溶血液。
(2)取洁净玻板划成方格，写上编号，滴上述溶血液1滴于方格内，再加炭粉抗原液1滴，以牙签混匀，轻轻振摇，经1～3min，即可观察结果。
(3)分别以++++、+++、++、+和一记录凝集强度，出现++以上凝集者判为阳性。
3．注意事项
(1)炭粉抗原在目前需用已知强阳性血清测定其效价。强阳性血清1∶128稀释时仍是++以上凝集、阴性血清1∶8稀释不出现假凝集、生理盐水对照不出现自凝者方为合格，不合格抗原不得使用。
(2)玻板上反应温度以10～35℃为宜。
(五)协同凝集试验 葡萄球菌A蛋白(SPA)是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质成份，能与多种哺乳动物IgG分子的Fc片相结合，结合后的IgG仍保持其抗体活性，当此覆盖着特异性抗体的葡萄球菌与相应抗原结合时，就可相互连接引起协同凝集反应，在玻板上数分钟内即可判定结果，现已广泛用于快速检测细菌、支原体、病毒等颗粒抗原，甚至可溶性抗原。
以检测猪败血链球菌为例。
1．材料准备
(1)器材 同乳胶凝集。
(2)稀释液 0．1MpH7．2，PBS按常规方法配制。
(3)SPA菌液 以标准菌株Cowan I或国内选育的1800株葡萄球菌在葡萄糖营养琼脂上培养18～24h，用PBS将菌苔洗下，收集沉淀用PBS洗涤2次。加0．5%甲醛生理盐水，制成10%(V／V)菌悬液，置室温3h，离心去上清，用PBS洗2次，积压菌体再用生理盐水恢复到10%菌悬液，并加叠氮钠至0．1%浓度。此即SPA菌液，在4℃冰箱可保存数月。
(4)致敏SPA菌液 取上述SPA菌液1ml，以PBS洗涤2次，将沉淀恢复至1ml，加入猪败血链球菌抗血清0．1ml，充分混合后，置37℃水浴30min，不时轻轻摇动，使抗体充分与SPA结合，离心去上清，再用PBS洗2次，沉淀用含有0．1%叠氮钠的生理盐水制成1%SPA致敏菌液。
(5)待检菌液 将猪血链球菌接种于血清肉汤中，37℃培养过夜，分接种1支猪丹毒杆菌作对照用。
2．试验方法 取洁净玻片用蜡笔划成3格，第1格加猪败血链球菌液体培养物1滴，第2格加猪丹毒培养物1滴，第3格加空白培养基1滴，各加入以致敏SPA菌液1滴，混合后，在半分钟之内即出现明显凝集者(++++或+++)为阳性，凝集颗粒小者(++)为可凝，液体混浊为阴性(+、-)。
3．注意事项
(1)本法可用以直接检出病猪血液和内脏中的病原，可分别制备链球菌、猪丹毒和猪瘟等的抗体致敏SPA菌液，与急性死亡的病猪血清或脾淋悬液作协同凝集试验，以供快速诊断。用于猪瘟诊断时，需含毒量很高才能检出，故出现阴性时不能排除猪瘟。
(2)犊牛、山羊和禽类的IgG不能与SPA结合，不能应用致敏SPA菌液。
(3)本法用于肠道传染病效果最好，通常需在增菌培养基上培养过夜再测，粪便中菌数高时亦能直接测出。