酶免疫技术
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第168页（13383字）
酶免疫技术是用酶标记抗体或抗原，以酶促反应指示免疫反应的一类测定相应抗原或抗体的性质、含量及其分布部位的方法。是继荧光免疫与放射免疫技术之后的又一类非放射性标记免疫技术。酶免疫技术具有标记物稳定性好，无放射性污染的优点，还可利用催化标记物进行放大和自动化分析处理。本法包括酶免疫组织化学和酶免疫测定两大类。前者主要用于抗原或抗体的定位分析，后者则主要用于抗原抗体的定性定量分析。
一、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA)
本法是将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并不使其丧失免疫活性，而将相应抗体或抗原用酶标记，使其既保有酶性又带有免疫活性。当它们之间互相反应后，去掉游离酶标记物，即可用酶-底物反应来指示抗原-抗体的结合，从而达到测定抗原抗体的目的。
(一)酶标记物的制备
1．常用酶 常用于EIA中酶主要有辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HPP)、碱性磷酶(Alkaline phosphatase AKP)、β-半乳糖苷酶(β-D-Galactosidase β-Gal)、葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase GO)等。由于HRP活性稳定，容易标记，其活性受标记的影响不大，来源方便，价格相对便宜。故此，仍被普遍使用。
2．免疫球蛋白提纯 用作标记用的免疫球蛋白应为高纯度的制备物(参照上节)，在必要时，除了进行盐析，凝胶过滤，离子交换纯化外，还需用亲和层析法制备。
3．葡萄球菌A蛋白(SPA) SPA是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种结构蛋白，它能与很多动物的IgG与IgM等抗体上FC片段结合，故常以其代替动物的抗抗体用于简接法ELISA。已有商品供应。
4．标记方法 以HRP标记抗体为例说明标记程序。
(1)过碘酸钠氧化法(Nakane氏法)
①称取4mg辣根过氧化物酶(RZ=3．0，活性单位200U／mg蛋白)，溶于1．0ml蒸馏水中，加入0．2ml新鲜配制的0．1Mol／L的NaIO4，置室温下搅拌20分钟，此时溶液颜色从棕黄色变为灰绿色，如颜色不变，需添加NaIO4溶液；
②于4℃下对1Mol／L醋酸钠-醋酸缓冲液(pH4．4)中透析过夜；
③将1ml含8mgIgG或4mgA蛋白的生理盐水溶液加于酶溶液中，立即加入15μl1Mol／L碳酸盐缓冲液(pH9．5)于室温下搅拌2h；
④于混合液中加入0．1ml新鲜配制的NaBH4或KBH4溶液(4mg／ml H2O)，于4℃下放置2h。于4℃下对PBS透析过夜。保存于4℃下予以纯化。
(2)一步戊二醛法(Avrameas氏法)
①将5mg辣根过氧化物酶溶于0．5ml PBS(pH7．2)抗体溶液中(含IgG2．0mg)，对PBS透析过夜(4℃)；
②用PBS补足体积达1．25ml，加入10μl25%戊二醛溶液，混匀，置室温下放置2h，于4℃对2000ml PBS透析过夜，换液一次；
③用PBS将混合液稀释成4ml，保存于4℃下，待纯化。
(3)二步戊二醛法
①将10mg辣根过氧化物酶溶于0．2ml含1．25%戊二醛的PBS(pH6．8)中，室温下放置过夜；
②对生理盐水透析(或过Sephedex，G-25柱一次)，以去掉游离戊二醛，用生理盐水调整到1．0ml，若体积过大，应予浓缩，此即为活化酶液；
③用1ml含5mg IgG与1．0ml活化酶混合，加入0．1ml碳酸盐缓冲液(pH9．5)，混匀后于4℃下放置24h；
④加入0．1ml0．2Mol／L赖氨酸溶液，于室温下放置2h，对PBS(pH7．2)透析过夜(4℃)，待纯化。
5．标记物的纯化 纯化的目的是除去标记物中游离的酶成分，降低非特异性反应，除去未标记抗体，以提高标记物的比活性，常用方法有：盐析法和凝胶过滤(参见上节)。
6．酶标物的保存 将上述纯化的酶标记物溶液，加入牛血清白蛋白(BSA)至终浓度达1%有助保存，如需长期保存，则加入等体积的甘油，分小瓶保存于-20℃下即可，切忌反复冻融。在条件许可的情况下，最好用冷冻、干燥、真空保存于低温(4℃～8℃)。
冻干时，可用0．5%BSA的PBS溶液，或蔗糖溶液、右旋糖苷溶液将酶稀释，小瓶分装，再进行冻干。
(二)材料和试剂
1．固相载体 常有用作ELISA的固相载体有以下几类。
(1)聚苯乙烯微量滴定板，过去主要靠进口(如Dyna rch Lab Inc及Organon Tekenick公司的产品)，近几年国内也有产品供应，常用4×10孔和12×8孔板，由于其非特异性吸附低，试验效果很好，特别适应于测定抗体的间接法。
(2)聚氯乙烯微量滴定板，此板的吸附能力比聚苯乙烯板的强，单位面积内吸附的蛋白量多，吸附速率高，特别适应干测定抗原。
(3)聚苯乙烯珠及试管，也是常用的固相材料。此外，还有聚苯乙烯反应条也得到了广泛应用。
原则上，以上材料出厂后，不需进行处理。相反，用酸、碱等处理过的材料的吸附性能会降低。鉴于国产材料出厂时把关不严之弊，在使用前，先应认真挑选，去掉那些表面粗糙，粘有污物，透明度差的板，再经自来水冲洗数次后，浸泡于蒸馏水中过夜，在40℃下烘干即可使用。
2．包被缓冲液(碳酸盐-重碳酸盐缓冲液0．1Mol／L pH9．6)
Na2CO3 0．59g
NaHCO3 2．93g
NaNO3 0．2g
H2O 1000ml
于4℃下保存，最多使用2周。
如果此液不理想，可改换较低pH的Tris缓冲液或PBS，某些单克隆抗体就是如此。
PBS(0．1MIL，pH7．4)
NaCl 8g
KH2PO4 0．2g
Na2HPO4·12H2 O 2．9g
KCl 0．2g
H2O 1000ml
于4℃下保存。
4．PBS-T PBS-T用作洗涤用，是在PBS中按0．05%加入吐温20即可。
5．稀释液 于PBS-T中加入BSA终浓度达0．5%。
6．终止液(2Mol／L H2SO4)或0．1%明胶或4%马血清。
H2SO4(浓) 22．2ml
H2O 177．8ml
7．酶底物溶液 酶催化的底物具有高度的专一性，不同的酶所用的底物是不同的。过氧化物酶底物液的配制：
(1)邻苯二胺(OPD) 先配制柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5．4)，即将0．1Mol／L柠檬酸24．7ml与0．2Mol／L Na2HPO4·12HO2 25．7ml混和，然后将20mg OPD溶于50ml缓冲液中，临用前加入20μl30%H2O2。此溶液对光敏感，应避强光直射，现配现用，当反应20～30分钟后，溶液显橙黄色，用硫酸终止后显棕黄色，在波长490nm处测定。
(2)3．3′，5．5′-四甲基联苯胺(TMB) 10mg TMB溶于1．0ml二甲亚砜中，并将其逐滴加入100ml0．1Mol／L醋酸钠柠檬酸缓冲液(pH6．0)中，加入20μl30%H2O2，现配现用。当酶分解TMB时，颜色为苍绿色，当用2Mol／L H2SO4终止后，而呈亮黄色，在波长450nm处测定。
(3)5-氨基水杨酸(5-ASA) 结晶5-氨基水杨酸100mg溶干100ml 0．01Mol／L PB(pH6．0)中，含1m Mol／L EDTA。临用前加入20μl30%H2O2。反应终止液用1Mol／L NaOH溶液，颜色为棕色，在波长450nm处测定。
8．酶联免疫检测仪 可用华东电子管厂生产的DG3022A型酶联免疫检测仪，该机结构简单，使用方便，微机控制，结果数字显示，自动打字，并可输入程序，判定结果。
(三)试验的基本程序
1．包被 将一定浓度(经预测确定)的抗原(或抗体)溶于包被缓冲液中，加入微量滴定板，每孔100μl，置4℃下作用12h，用PBS-T洗涤3次，甩干。
2．分层加样 各孔加入与包被物相对应的试样100μl，37℃反应1～2h，同上法洗涤3次，根据试验需要可加一层、二层或更多层次，每加一层均需同上法反应、洗涤。
3．加入酶标记物 最后一层必须加入与前一层相对的标记抗体(或抗原)，也可用能与上一层相结合的其他酶标记物，如酶标SPA。37℃作用1～2h后，洗涤3次。
4．显色 各孔加入底物溶液100μl，室温20～30min，加2MH2SO4 50μl终止反应，本法最常用的底物溶液为OPD液。
5．测定吸光值(A)，在ELISA检测仪上以指定波长测定A值，用OPD显色所用波长为490nm，定性试验亦可用肉眼观察，根据颜色深浅判定结果，橙色或黄色者判为阳性，浅黄而接近无色，与对照无显着差异者判为阴性。
(四)试验法类型 根据加样层次和酶标记物不同，其方法可分很多类型，可按测试对象和试验目的不同选用最适的方法，常见的类型如下。
1．间接法 用于测定抗体，其操作程序为：抗原包被→待检血清→酶标抗抗体→底物显色。如待检血清为人、猪、兔、牛等动物时，亦可用酶标SPA(PFA)代替酶抗抗体，称为PPA-ELISA。
2．双抗体法 用于检测大分子抗原，其操作程序为：抗体包被→待测抗原→酶标抗体→底物显色。
3．双夹心法 既可用于测大分子抗原，也可用于测抗体。本法需制备与待测抗体不同源的第一抗体(Ab1)和针对待测抗体的抗抗体(Ab2)，其程序为：异源Ab1包被→待测抗原(或已知抗原)→同源Ab1(或待测抗体)→酶标Ab2→底物显色。
4．竞争法 用于测定小分子半抗原，分试验组、对照组作平行试验，其操作程序为：
对照应显色，可根据颜色变浅的程度，估测待测抗原含量。
5．酶标生物素和亲和素复合(ABC)法 当待检样中抗原含量很微量时，可用生物素(B)-亲和素(A)系统使ELISA反应放大，从而提高灵敏度，本法需制备生物素标记抗体和酶标记生物素，以亲和素搭桥使二者连接，其操作程序为：抗体包被→待测抗原→生物素标记抗体→亲和素和酶标生物素复合物(ABC)→底物显色。ABC已有商品供应。
6．酶—抗酶抗体(PAP)法 用于检测抗体，需事先制备可溶性酶-抗酶抗体复合物(PAP)和搭桥用抗抗体。其程序为：抗原包被→待测抗体(兔)→羊抗兔→PAP(抗酶抗体用兔制备)→底物显色。如待测抗体为猪抗体，则其后尚需加一层兔抗猪。其后再加羊抗兔，PAP已有商品供应。
(五)待检血清A值的校正 为了使不同次实验的结果便于比较，特别是进行半定量或定量试验时，实测样品的A值需与标准阳性血清A值进行校正，通常是将指定稀释度的标准阳性血清A值调整至1．0。即试剂盒中供给的标准阳性血清的A值为1．0。读取样品和阳性血清的A值后，按下式进行校正。
如待检物是抗原，亦需同样进行校正。
(六)结果表示法 本法可用于定性、半定性和精密定量，根据要求不同有很多结果表示方法。
1．吸光度值(A)法 主要用于定性试验，可直接用吸光度的校正值来表示。通过将大批阴性样品测定时所得的校正值进行统计，算出XN±SD，然后以XN+2SD或X+3SD作为阳性临界值(PNTV)，大于PNTV者判为阳性。
2．P／N比值法 是待检样品校正值与阴性样本校正均值之比值，即：
以P／N比值大于2或3判为阳性。
3．终点法 用于半定量是将待检样品进行同样的连续倍比稀释，试验后，以出现阳性的最大稀释度作为反应终点。
4．绝对含量法 此法主要用于小分子半抗原的定量分析。每次试验时，均需用一块板作标准曲线，将反应所得的A均值对浓度进行直线回归，测样品的A均值(通常用2～4孔)后，即可按公式或在标准曲线图上算出待检样的浓度。
5．50%抑制率 在竞争法中，一般是抑制率表示，并根据抑制率与浓度的关系可以估算出样品中待测物含量。抑制率是指使已知标准样反应的吸光值降低一半的百分率(50%)。以待检样使标准样反应抑制50%时判为阳性，抑制率的计算公式为
以抑制率对浓度进行回归(或作图)，据此就对未知样本进行测算。
(七)应用实例
例一 PPA-ELISA测猪瘟抗体
本法用于猪瘟防疫效果监测，防疫密度检查和群体免疫水平的分析。
1．材料准备
(1)器材 参见(二)。
(2)纯化抗原 用猪瘟兔化毒的细胞培养物浓缩提纯制成，为冻干制剂，用前稀释。
(3)标准阳性血清和阴性血清 均用猪制备，冻干，用前稀释。
(4)各种缓冲液，包被液、洗涤液和底物溶液等均按说明书稀释。
上述制品已有成套诊断药盒供应。
2．操作方法
(1)用包被液将纯化抗原稀释成1∶80，加入滴定板，每孔100μl，置4℃作用12h，洗涤3次，每次1～3min，甩干。
(2)用稀释液将待检血清作1∶80稀释，加入滴定板，每孔100μl，每样做双孔重复。另设阳性血清、阴性血清和空白对照各2孔，分别加1∶80的血清和稀释液100μl，置37℃反应2h，洗涤3次。
(3)加入1∶120的酶标SPA(PPA)溶液，每孔100μl，置37℃作用1h，同上法洗涤3次。
(4)每孔加底物溶液100μl，于37℃作用20min，加入50μl浓硫酸终止反应。
(5)用波长为490nm的滤光片，测定各孔A490。
3．结果判定
(1)A490＞0．17(XN+3SD)者判为阳性，≤0．17为阴性。
(2)A490 0．3为100%保护线，＞0．3者攻毒100%保护，＞0．17至＜0．3的猪攻毒保护率在75%左右，＜0．17的阴性猪，如为母源抗体则攻毒不保护，如系免疫猪则仍有少数可获保护，但在估测群体免疫水平时可以忽略不计。
(3)群体总保护率估算公式为
免疫良好的群体总保护率多在95%以上，总保护率小于50%者，显示免疫无效，属猪瘟易感群体。阳性率低的群体上述公式可出现误差，说明书上另有检索表可供查照。
4．注意事项
(1)为减少操作误差，待检血清所测得A值应按(五)法加以校正。
(2)如采用DG3022A型酶联免疫检测仪，该机备有相应软件，只需按说明书输入所需数据，先测标准阳性孔，然后按编号顺序检测各样品孔，即能自动打印出样品号，校正后的A值及其均值、ET(ELISA效价)、阴性还是阳性(-／+)、是否达到保护线(P／D)等数据。
例二 ELISA法测定孕酮
检测体液中的孕酮水平，不仅用于家畜的发情鉴定和妊娠诊断，而且可以监测母体生殖疾病。已有试剂盒供应。
1．材料准备
(1)孕酮标准品和酶标记物 风干和冻干分装，用前按说明书稀释。
(2)抗孕酮IgG 冻干分装，用前稀释。
(3)缓冲液 包被液、稀释液、封闭液、洗涤液、酶标化物溶液和底物溶液等均按说明书稀释，4℃保存备用。
(4)器材 参见(二)。
2．操作方法
(1)抗体包被 用包被缓冲液50ml稀释抗孕酮IgG(5支)，加入96孔滴定板，每孔100μl，A、B、C排的第1孔不加抗体包被，留作空白对照，加盖置4℃冰箱，包被20～24h。
(2)封闭 取出包被板，甩掉包被液，然后在各孔内加封闭液200μl，室温反应1．5～2h后，甩掉封闭液，用洗涤液洗涤5次，每次静置2～3min，最后，用吸水纸将板吸干。置于干燥器内4℃保存备用(可保存二个月)。
(3)样本稀释 取样本25～50μl，用测定缓冲液稀释100～200倍(根据样本预测的孕酮水平而定，以保证稀释后样本中的孕酮水平在标准曲线范围内)。
(4)加样 在包被A排第2～12列各孔内依次加待测样100μl／孔，B、C排重复A排加样。在D、E排按照0；12．5，25，50，100，200，400，800pg／ml的顺序加标准孕酮，每个梯度重复3次，作为标准曲线对照，F、G、H三排中，第1～12列各孔内依次加待测样，每板可测23个样品。加样后，将板置于冰箱中(5～10分钟)，同时配制标记液。
(5)加标记物 取出载体板，各孔内加标记液25μl，置于37℃培养箱中反应30min。
(6)取出反应板，甩掉反应液，用洗涤液洗涤5次，每次2～3min，同时配制底物液。
(7)各孔内加酶底物液100μl，于室温避光反应40～60min，此时反应孔内液体呈绿色。
(8)各孔内加终止液25μl，此时反应孔内液体呈黄色。
(9)用酶标仪在450nm波长处读取各孔的吸光值(A450)。
3．结果计算 以浓度为横座标，不同孕酮浓度的A450均值为纵座标，用半对数坐标纸绘制标准曲线。待测样本的A450均值在标准曲线上所对应的横坐标值，乘以稀释倍数即为待测样本的孕酮含量。也可将标准曲线直线化。设孕酮浓度为x，光密度值的logit值(
)为y。可得回归方程y=A+Blgx，当相关系数为-0．995以上时，回归方程有效，否则需剔除坏点。
二、免疫酶组化法
以酶标抗体来探查组织细胞内外抗原分布及含量的示踪技术，与荧光抗体法相似，但以酶标抗体代表荧光抗体，然后通过生色产物为不溶性固定的显色剂如3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐进行显色，反应产物呈棕色微粒沉淀于酶标物的部位。结果不需用荧光显微镜，而只需要普通显微镜或放大镜就可观察。阳性反应者为棕红色。
(一)材料准备
1．器材 玻片、显微镜等。
2．酶标抗体 同ELISA法，用前稀释至最适浓度(事先滴定)。
3．溶液配制
(1)底物溶液
3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB) 25mg
0．05mol／LpH7．6Tris-HCl缓冲液 50ml
(即将25ml0．2M三羟甲基氨基甲烷加39ml的0．1 N HCl即配成)
30%H2O2 15μl
将DAB倒入缓冲液中，避光，搅拌3h，置4℃下避光。临用前，用滤纸过滤后，加入H2O2即使用。
(2)抑制内源酶溶液
0．01mol／L，pH7．4 PBS 100ml
30%H2O2 30μl
1%NaN3 1ml
(3)洗涤液和稀释液 同ELISA法。
(二)操作方法
1．制片、固定同荧光抗体法。
2．将固定后的标本片浸于抑制内源酶溶液中，37℃作用30min以消除其同源酶，置洗涤液缸内，洗涤3次，蒸馏水缸内洗涤2次，每次3min。
3．取出，自然干燥或吹干，滴加最适稀释的酶标抗体，置湿盒内37℃作用45min，用上法洗涤。
4．不等玻片干燥，将其浸于底物溶液中，置37℃作用30min，洗涤同前。
5．吹干，镜检。
(三)结果判定 抗原所在部位染成棕黄色，着色细胞为阳性细胞。
(四)注意事项
1．试验时应取健康组织用同法染色作为对照，以观察是否出现非特异性染色。
2．标本片用PBS代替酶标抗体染色，以观察内源酶是否被抑制。
3．本法亦可应用间接法，PPA(即酶标SPA)法等，可参见ELISA法。
三、限量抗原底物珠法(DASS)
琼脂糖珠Sepharose 4B经CNBr活化后，抗原(或抗体)可共价结合到珠表面，表面残存的活性基团可用氨基化物如乙醇胺进行封闭，将此珠与相应待检物进行反应就在其表面形成免疫复合物，再用酶标抗体等反应，以类似酶免疫组织化学进行染色，观察。
(一)底物珠的制备
1.抗原底物珠的活化 如果所购的Sepharose4B已经溴化氰活化，可以直接与蛋白质偶联，否则可按下述进行活化。
(1)将大小适中的二层新华滤纸贴于布氏漏斗上，用蒸馏水浸湿后，倒进Sepharose4B珠悬液。抽干后用蒸馏水洗3～5次(共2000ml左右)，再抽干；
(2)称取抽干后的Sepharose4B凝胶，并按每克重量加入1．0ml5mol／L磷酸钾缓冲液(4℃)充分悬浮凝胶；
(3)在通风条件下，按每克凝胶重称取25～30mg CNBr(预先在乳钵中碾碎)，并溶于1．0ml冷蒸馏水中，搅拌溶解；
(4)在搅拌条件下，将其缓缓滴于Sepharose4B悬液中，2min内加完，反应8～10min(20℃)；
(5)倒入布氏漏斗，迅速用1～4℃的蒸馏水洗涤，保证每克凝胶不少于50ml蒸馏水；
(6)最后用0．1mol／L NaHCO3(含NaCl0．5mol／L)洗涤(每克凝胶25ml)，2～3min内完成，并恢复原体积，此即为活化的Sepharose4B珠。
2．Sepharose4B的致敏 于烧杯内将抗原用0．1mol／L NaHCO3(含NaCl0．5mol／L)稀释成1mg／ml，立即与等体积的活化的Sepharose4B珠混合，并于室温下搅拌6h，离心500rpm，收上清液。继续用0．1mol／LNaHCO3液洗涤6次，合并上清，并测算蛋白含量，根据下述公式计算交联率
3．致敏Sepharose4B珠上残存活性基团的封闭于致敏的Sepharose4B凝胶中，加入5倍体积的0．5mol／L氨基正丁酸溶液中，室温下搅拌6～18h。离心，并用5倍体积的0．1mol／L硼酸盐缓冲液和醋酸缓冲液交替洗涤3次。最后用0．01mol／LPBS洗涤3次，悬浮于PBS中，加入0．1%NaH3保存于4℃冰箱，或用25%乳糖保护冷冻干燥。以上就为制备好的限量抗原底物珠。同样，也可制成限量抗体底物珠。
(二)溶液配制
1．稀释液、洗涤液和底物溶液均参照上节。
2．乙醇-乙醚(1∶1)混合液(玻片清洗用)。
3．2%明胶铬矾溶液(涂玻片用)。明胶2g，加水100ml，于60℃水浴中溶解，加入铬矾50mg，于4℃下保存。
(三)试验方法
1．取洁净无划痕的玻片用无水乙醇-乙醚混合液浸泡12h，取出待挥发干后，涂一层2%明胶液，于室温下空气干燥2h；
2．将玻片划成10个方格，上排每格加致敏底物珠10～20粒，再在室温下干燥2h以上。此种制备片在4℃下可保存1周，-50℃下可保持数月；
3．在底物珠表面上加上待检血清10μl，反应30min(37℃)，用含0．5mol／LNaClPB洗10min，反复2次；
4．晾干后，加上稀释的酶标抗抗体(或酶标A蛋白)10μ1，反应30min。
5．洗涤两次后，加底物溶液1滴显色5min。浸入0．05mol／LTris-HCl缓冲液，漂洗20min，取出凉干。
(四)结果观察 于显微镜下低倍放大观察，阳性标本呈不同程度棕黄色，阴性应不显色。
(五)注意事项 试验时，在每块玻板上，应设立阴性血清，阳性血清和未致敏底物珠对照，以免误判实验结果。