埃希氏菌属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第242页（5292字）
埃希氏菌属除具有肠杆菌科的特性外，其主要生化特点吲哚阳性、M．R．阳性、V．P．阴性、不利用柠檬酸盐、不产生H2S、不分解尿素(有的不脱羧埃希氏菌可能分解尿素，但兽医微生物检验工作中罕见)、发酵乳糖(少数迟缓发酵)及另外一些碳水化物产酸又产气(CO2及H2)。此属中致病菌及卫生检验中最常遇见的是大肠埃希氏菌(E．coli)，系人类和其他动物肠道后段的常住菌，故常将此菌的有无或多少作为饮水、食品、用具等卫生评价的依据。已往多认为它是条件性致病菌，现确认其中部分是真正的致病菌。
形态染色特性：革兰氏阴性，卵圆形或杆状，大小为1～3×0．4～0．7μm，单独或成双存在，无芽孢，无荚膜，大多数能运动，具周身鞭毛。多数菌株在适宜培养条件下可以出现菌毛，是取得营养、传递质粒的通道，也是噬菌体接触的地方，还能使某些动物的红细胞发生凝集。这种凝集性能有的因甘露糖存在而不出现，称为甘露糖(Manose)敏感(Sensitive)株，简称为MS株；另一些称为甘露糖抵抗(Resistent)株，简称为MR株，即有甘露糖时仍照样凝集。
生长要求及培养特性：见检验项下。
生化特性：见表11-1及表11-3。
抗原结构与血清型：本菌有O、K、H抗原，据此分成不同的血清型，O抗原有170种、K抗原99种和H抗原52种。根据对大肠杆菌(即大肠埃希氏菌)的鉴定，可写出某型大肠杆菌的抗原式。如O111∶K58(B)∶H12，表型该菌具O抗原111、K抗原58属于B类、H抗原为12。
血清型与病原性：不同血清型的大肠杆菌可使不同的动物致病，但有的血清型能使多种动物发病，见表11-4。
表11-4 大肠杆菌血清型与畜禽疾病
检验方法及步骤如下。
样品采集：可采取病畜禽的小肠及内容物；败血病例可取血液或肝脾肺肾等；见腹膜炎、肉芽肿、气囊炎时，采取局部病变组织；死胚取其尿囊液、卵黄；腹泻病例可以灭菌棉拭从直肠采取粪便。
细菌培养：采样作划线，接种于普通琼脂平皿、麦康克培养基、血琼脂平皿，于37℃培养24h。大肠杆菌在普通的营养琼脂上形成直径约2mm、圆形、隆起、光滑、湿润、半透明带淡灰色的菌落，在麦康克琼脂上的菌落为红色，部分致病性大肠杆菌在血平皿上出现3型溶血。挑取上述菌落，涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性中等大小杆菌，作成纯培养，移植到三糖铁琼脂上，并继续作生化反应，如具下述特性，即可作大肠埃希氏菌的诊断报告，即：乳糖、葡萄糖均产酸产气，ONPG阳性，产生吲哚，M．R．阳性，V．P．阴性，不利用柠檬酸盐，不产生H2S，不分解尿素，运动，KCN中不生长。
血清型鉴定：对已诊断为大肠杆菌，如有需要，可将18h的固体培养物洗下分成两份。一份经121℃处理2h成加温菌液，另一份加福尔马林(通常为40%甲醛)使福尔马林含量达0．5%并置于37℃24h成为未加温菌液。以加温菌液(只含O抗原)和已知型的O血清作玻片凝集试验，阳性者可定O抗原的型；以未加温菌液(还含K抗原)与各O血清不凝集后，用已知的各单价的OK血清作玻片凝集试验，阳性者可定K抗原型，以此可作出大肠杆菌O、K抗原型的报告。已知血清可向有关生物制品厂洽购，或向江苏农学院兽医系联系。
动物试验：对小猪黄痢的诊断，欲作动物试验，可将分得的大肠杆菌18h肉汤培养物0．5ml口服感染未吃初乳的新生仔猪，如发生黄痢，更可确诊。
甘露糖抵抗株或敏感株的测定：大肠杆菌K88为仔猪下痢的重要病要菌，有K88血清，可定分离株是否有K88抗原，如无此血清，可用此法间接推断，因为大肠杆菌K88能凝集豚鼠红血球，这种凝集性，不能为甘露醇所阻止，即它是甘露醇抵抗株，不是甘露醇敏感株。
试验时将被检大肠杆菌接种于肉汤中培养18小时后，移植于牛心肉汤琼脂斜面上(牛心肉汤琼脂制备法与肉汤琼脂同，仅以牛心代替牛肉)，37℃培养18h后，以灭菌生理洗下菌苔，配成每ml生理盐水6亿(即相当于麦氏比浊管第2管的浓度)，同时以无菌的含甘露醇0．5%的生理盐水制备同样浓度的菌液。另制备3%豚鼠红细胞［从豚鼠心脏采血1～2ml，置于含柠檬酸钠5%的无菌生理盐水约10ml中，混匀，以无菌生理盐水离心洗涤(5000r／min，20min)三次，取最后一次离心浓缩的红细胞0．3ml加到9．7ml无菌生理盐水中混匀即成］。将等量的细菌液与血细胞液(试管反应，各0．5ml；微量凝集板反应，各0．025ml)。混和，置0～3℃下一小时后观察结果，另设等量血细胞液与生理盐水液的血细胞对照，此对照应不凝集。如无甘露糖的菌液与血细胞凝集，而有甘露糖的菌液与血球不凝集，该菌株为甘露糖敏感株，无K88抗原；如有甘露糖及无甘露糖的菌液均与豚鼠血细胞凝集，则该菌株为甘露糖抵抗株，有K88抗原。这种血细胞凝集发生在低温(0～3℃)，低温下凝集的血细胞，在37℃下半小时，凝集现象消失，再置于0℃下一小时，凝集又出现。
大肠杆菌肠毒素的检测：许多致病性大肠杆菌，特别是引起仔猪腹泻的，能产生肠毒素，有的耐热，有的热敏，可预检测。
一、大肠杆菌热敏肠毒素的检测
1．热敏肠毒素的制备 将被检大肠杆菌接种到1ml的CaYE-2培养基，37℃培养18h后，将此1ml培养物加入到盛有15ml同样培养基的100ml三角瓶中，仍置37℃培养18h后取出，加入硫柳汞达万分之一(加1%硫柳汞0．15ml)，冰箱中过夜杀菌，次日以3500r／min离心20min，取上清液，供热敏肠毒素试验用。此液应新鲜制备，在冰箱中保存不宜超过3天。
CaYE-2培养基，可称“酪蛋白酵母浸膏培养基”，系将酪蛋白水解物(Casein hydrolysate)10g，酵母浸膏(Yeast Extract)3g，氯化钠1．25g，双盐基磷酸钾(K2HPO4·3H2O)5．7g，微量盐类混合液(MgSO45g、MnCl30．5g、FeCl30．5g溶于100ml的0．001N的H2SO4中)0．5ml，溶于480ml左右的蒸馏水中，加蒸馏水使总量为500ml，滴定pH至8．0，分装，13．5磅灭菌15min后，冷却备用。
2．热敏肠毒素的检测
(1)兔皮肤蓝斑试验 将成年健康白兔的背侧部剃毛，或在该部剪毛后涂以脱毛剂(硫化钠8g、淀粉7g、白糖4g、甘油5g、硼砂1g、水75ml，混匀)5min后以温水洗净，该部即脱毛。将无毛部的皮肤区分为15mm见方的小格，在小格的中央皮内注射检测的滤液0．1ml，每一检液做一个重复；在邻近的另一方格中央，皮内注射未接种细菌的CaYE-2培养基0．1ml作为培养基对照；另外又接种加热过(65℃10min)的被检滤液到另一方格，作为毒素热敏对照。24h后向接种兔耳静脉注射1%伊文思蓝(Evans′ blue)生理盐水液4ml，6h后观察，观察到24h为止。蓝斑直径大于7mm以上者为阳性，培养基对照及毒素热敏对照，均应是阴性。
(2)乳兔口服试验 取7～9日龄乳兔，每克体重口服被检热敏肠毒素0．05ml(用细、头光而圆的塑料管，引入小兔食道，如引入到气管则有咳嗽或管中有空气出入)，5h后将乳兔麻醉死，剖检，并称肠道重(x)与剩余体重(y)，当x∶y≥0．085为阳性，因为热敏肠毒素能引起肠道炎症、水肿；如x∶y≤0．074为阴性；比值介于0．073～0．084为可疑。
另设培养基对照及毒素热敏对照，与兔蓝斑皮肤试验同，二者均应为阴性。
(3)兔迥肠结扎试验 取重为2kg以上的健兔，给水饥饿2日。以外科手术切开腹壁，自盲肠游离端处的回肠开始，沿向心方向结扎，每结扎8～10cm一段，间隔3～5cm，又结扎8～10cm一段，再间隔3～5cm，又结扎8～10cm一段……。向其中一段肠腔注射被检热敏肠毒素1ml，向另一段肠腔注射1ml培养基作为对照。注射完后缝合，给饮水饥饿12h后，将兔扑杀，测结扎肠段内的液体量(ml)与结扎肠道长度(cm)的比，ml∶cm＞1者为阳性，培养基对照段的比值应小于1。
二、大肠杆菌耐热肠毒素的检测
将被检菌接种于“胰蛋白胨黄豆汤”或“胰胨大豆汤”管中，37℃培养16h后，取0．5ml到含5ml同样培养基的100ml三角瓶中，37℃培养16h，将其一半加热(65℃，10min)，另一半不加热。将加热的菌液与未加热的菌液，各胃内接种3～5日龄乳鼠5头，每头0．1ml，其中还加有一小滴2%伊文思蓝，以便将来证实此0．1ml入胃。另以培养基或不产生肠毒素的细菌培养物作为对照。接种后2～3h将小白鼠麻醉死，剖检，取出肠道及肠内容物，称肠道及其内容物重(x)与剩余体重(y)之比值，x∶y≥0．085者为阳性，x∶y＜0．074者为阴性，比值介于0．075～0．084者为可疑。培养基对照应为阴性，有耐热肠毒素时，加热及未加热的菌液均应为阴性。
胰蛋白胨黄豆汤的制备法为 黄豆粉50g、NaCl5g、水1000ml、浓盐酸1ml，充分混合，在40～45℃水浴中16～24h，煮沸，棉花纱布过滤至清朗，加胰蛋白胨30g，待溶，补足水份至1000ml，调pH至7．6，分装，灭菌，备用。供大肠杆菌产生毒素用。
麦康克(Maconkey)氏琼脂的做法是将蛋白胨20g、氯化钠5g、乳糖10g、胆盐5g，依次溶于1000蒸馏水中，校正pH至7．2，加入1%中性红水溶液5ml、琼脂20g，置高压锅中121℃灭菌15min，暂不开锅，约经半小时(琼脂中杂质沉于底部)，开锅，将上清倾注成平皿用。
本培养基中有胆盐，抑制革兰氏阳性菌生长；营养成分一般，生长要求高的革兰氏阴性菌不生长，故宜于肠杆菌科的分离；培养基中有乳糖及中性红，故能初步区分肠杆菌科中能发酵乳糖的(如大肠埃希氏菌)及不发酵乳糖的(如沙门氏菌、志贺氏菌)细菌，常用。
市上有国产去水麦康克氏琼菌出售，易购得，故多不自行制造。
胰胨大豆汤(Tryptic Soy Broth)的做法是取胰胨(Tryptone，酩蛋白的胰酶消化物)17g、大豆胨(Soytone，大豆粉的胃酶消化物)3g、葡萄糖2．5g、氯化钠5g、双盐基磷酸钾2．5g，将各物依次溶于1000ml蒸馏水中，调pH至7．3，分装，15磅15min灭菌。此培养基营养成分较好，既可用于致病性大肠杆菌产生毒素用，还可供奈氏球菌属、嗜血杆菌属等生长用，梭菌属及无芽孢的厌氧菌在此培养基中培养于厌气条件下，亦生长丰盛。
SS琼脂培养基系建议用来分离沙门氏菌(Salmonella)及志贺氏菌(Shigella)用，由于胆盐含量较高，粪便中大肠杆菌亦不易生长，故名SS琼脂。
肉膏5g，胰蛋白胨5g，乳糖10g，第三号胆盐8．5g，柠檬酸钠8．5g，硫代硫酸钠8．5g，柠檬酸亚铁1g，琼脂15g，亮绿(brilliant green)0．33g，中性红0．025g，溶于1000ml蒸馏水(加热)中，调pH至7．0，不需要高压消毒，因为一般的细菌在上面都不长，至45℃时倾注成平板应用。
大肠埃希氏菌为小的(直径小于1mm)红色(发酵乳糖)菌落。沙门氏菌、志贺氏菌长成较大(直径大于1mm)淡灰色菌落，能产生H2S的(如许多沙门氏菌)，菌落中心黑色。
附 检验程序
