钩端螺旋体

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第369页（3433字）

钩端螺旋体是人畜钩端螺旋体病的病原，几乎遍布全世界，已发现18个血清群和150个血清型。我国有16个血清群55个血清型，标准菌种定为13群14型，常见的有黄疸出血型、流感伤寒型、波摩那型、秋季热型、巴达维亚型、澳洲型、七日热型和犬型等。由于菌型不同，所致疾病的临床表现有所差异，但其主要症状为发热、贫血、出血、黄疸、血红素尿以及粘膜和皮肤坏死。

病原特性与实验诊断方法如下。

1．样品采集 病的早期以采取病畜的血液为宜。作显微镜检查和分离培养时，则应加抗凝剂，先以1000r／min离心10min再吸取上层血浆，以3000r／min离心30min取沉淀物镜检和培养。如作血清学检查，则不用加抗凝剂。病的后期肾脏中的病原体大量增加，宜采取尿液，按上法离心沉淀后，取沉淀物检查。死后采取肝、肾、肾上腺等实质脏器，加灭菌生理盐水磨碎，制成1∶10悬浮液，静置1h，取上清液检查。

2．显微镜检查

(1)暗视野检查 用铂耳取上述被检样品一滴，制成悬滴或压滴标本，用暗视野显微镜检查。螺旋体在暗视野显微镜下，因螺旋不易看清，常似一串发亮的细小珍珠，运动活泼，当绕长轴旋转或摆动时，菌端可弯绕成8字、丁字或网球拍等形状。由于屈曲运动，整个菌体可弯曲成C、S、O等字样。此种弯曲形状又可随时消失。

(2)染色标本镜检 将被检样品制成涂片，染色检查，用革兰氏染色不易着色，用姬姆萨染色或镀银染色较好，前法菌体染成玫瑰色；后者菌体染成黑色。常因螺旋过于致密，经硝酸银沉淀后，菌体增粗，螺旋不易显现，而似弯杆状。

3．分离培养 将被检样品接种于柯索夫(Korthof)液体培养基中，于28～30℃需氧条件下进行培养。钩端螺旋体生长缓慢，至少要培养两周，最好每5天作一次暗视野检查，一般在10～15天左右，即可发现钩端螺旋体。为了减少培养的污染，可在每100ml柯索夫培养基中加入5—氟脲嘧啶20mg或磺胺嘧啶400mg。每份材料至少应接种培养基3管，以增加获得阳性结果的机会。必须注意腐生性钩端螺旋体在形态上与致病性钩端螺旋体无法区别，可按下表进行培养鉴别。

表15-1 培养鉴别试验表

* 含0．0001%硫酸酮。

4．动物试验 一般采用幼龄豚鼠(体重150g左右)或仓鼠，经腹腔注入被检样品，豚鼠可在4～7日出现发热、黄疸等症状，孔后剖检可见皮下或肺脏有大小不等的出血斑，取其肝和肾组织研制成悬液作暗视野检查和培养检查。分离出钩端螺旋体后，用已知型特异性免疫血清作凝集溶解试验鉴定其型别。

5．血清学试验 动物感染钩端螺旋体发病的早期，其血清中即有特异性抗体出现，且迅速上升至高度水平，此抗体可长期存在。因此，用已知抗原检查动物血清中的抗体，是诊断本病极有价值的方法。另外，被检样品中的病原性钩端螺旋体，也可用已知抗血清进行检验，以作出诊断，并确定其血清学类型。

(1)凝集溶解试验 此试验具有高度的型特异性，是诊断本病最常用的方法。凝集素和溶解素在发病3～8天即在血中出现，第12天至第17天达到高峰，效价可高达1∶10000～1∶100000，甚至更高，动物痊愈后，此类抗体尚可保持一年以上。本试验所用抗原为5～7天生长良好的培养物。待检血清按倍比稀释，作成1∶50～1∶3200的各种稀释度，在一列小试管中加入不同稀释度的血清及抗原各0．2ml，混匀，置37℃水浴中2～3h，各管分别取1滴，置于载玻片上，加上盖玻片，用暗视野观察其凝集溶解现象。凝集现象是钩端螺旋体聚积成小蜘蛛状。溶解现象是钩端螺旋体呈颗粒状肿大和崩解。一般血清抗体含量高时，出现溶解，抗体较低时出现凝集。反应判定的标准为：引起凝集及溶解现象发生的血清稀释度达1∶800以上为阳性；1∶400为可疑。或对动物反复采血试验，若第二次的血清效价较上次增长四倍以上，亦可作为诊断的依据。

(2)间接红细胞凝集试验 病畜血凝抗体出现较显凝抗体为早，具有早期诊断意义。本法操作简便，适于兽医基层应用。其试验方法和一般间接血凝试验相同。首先提取钩端螺旋体致敏物质，制备醛化致敏红细胞(参阅免疫部分第二节项下间接血凝)，然后按下列方法进行试验。

先处理血清，将被检血清0．1ml加2．5%正常绵羊红细胞液0．4ml混匀，置于37℃水浴中1h，但要经常摇动，以吸收正常凝集素。离心沉淀后，再取其上清液即1∶5倍稀释的血清，用生理盐水稀释成1∶20～1∶640，每个稀释度各取0．8ml，分别加入两孔(一孔对照)，在试验孔内各加2．5%致敏红细胞悬液1滴，而对照孔则加2．5%正常绵羊红细胞1滴，充分摇匀，置于室温或37℃温箱内2h观察结果。判定标准：以试验组红细胞能引起“⁺⁺”凝集的最高血清稀释度作为抗体效价。效价1∶160以上，或双份血清效价增高四倍以上，可作为临床诊断依据。

(3)炭抗原凝集试验 按一般炭凝集试验方法，先将钩端螺旋体超声粉碎制成炭抗原，然后将被检血清56℃30min灭活后，用1%正常兔血清盐水稀释成1∶2～1∶64，各取1滴于玻板上，再加炭抗原1滴，摇匀后，于22～37℃静置10min，判定结果，能引起“⁺⁺”凝集最高稀释度为效价终点。1∶4以上或双份血清增高四倍以上，判为阳性，但要注意非特异性反应。

(4)补体结合试验 患钩端螺旋体病的病畜，其补体结合性抗体，于病后第三天即可出现，第四周达到最高峰，抗体可持续一年之久，故可用于诊断。本试验操作方法同于常规补体结合试验。但所用抗原为数型菌株混合抗原，具有属特异性不能用以定型，一般多用于流行病学调查。被检血清效价在1∶20以上才有诊断意义。当恢复血清效价比急性期增高四倍以上时，具有诊断价值。

(5)间接免疫荧光试验 本法检出率高达94%左右，具有早期诊断的优点。首先根据各地流行的主要菌型制备抗原片，一般用培养5～7天生长良好的菌液涂片，干燥、火焰固定后，再滴加灭活的不同稀释度的被检血清，置于37℃湿盒内作用30min，用pH7．4磷酸盐缓冲液冲洗剩余血清，干后滴加异硫氰酸荧光黄标记的抗体染色30min，再用同液冲去游离染色液，镜检，如钩体呈明亮的淡绿色荧光则为阳性。效价为1∶100以上或双份血清效价升高四倍以上，可作为诊断依据。

(6)酶联免疫吸附(ELISA)试验 本法敏感，特异性高，比免疫荧光简便，可用普通显微镜检查。其方法是：先将钩体抗体与抗抗体分别按ELISA一般方法提取球蛋白，以辣根过氧化物酶标记，然后按下列方法染色检查。

①直接染色法 先将辣根过氧化物酶标记的钩体抗体球蛋白制剂用生理盐水作1∶10稀释后，直接加于用福尔马林固定的钩体涂片，置37℃湿盒中染色30～50min，水洗两次(约5～10min)空气中干燥后，用联苯胺试剂显影(5%乙二胺四乙酸1ml，饱和氯化铵1ml，饱和联苯胺溶液9ml及3%过氧化氢溶液1滴)4～5min，水洗，加甘油缓冲液镜检。

②间接染色法 取福尔马林固定的钩体涂片，先加被检血清，即相应菌型抗体(效价1∶1000以上)置于37℃湿盒中30～50min，水洗两次后，再加辣根过氧化物酶标记的抗抗体染色30～50min，洗涤干燥后用联苯胺试剂显影，水洗，加甘油缓冲液，镜检。

上述两种染色法，钩体均呈棕黄色，判为阳性。