密螺旋体
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第373页（3966字）
密螺旋体是引起人畜密螺旋体病的病原。在兽医上重要的有猪痢疾密螺旋和兔密螺旋体两种。
一、猪痢疾密螺旋体(Treponema hyodysenteriae，简称T．h．)
猪痢疾密螺旋体为猪痢疾的病原。主要引起断奶猪发生粘液出血性下痢为特征。
病原特性与实验诊断方法如下。
1．样品采集 采取病猪急性期带血胨的新鲜粪便和结肠粘膜的刮取物及其肠内容。
2．显微镜检查
(1)直接镜检 将粪样直接涂片或用生理盐水5倍稀释，静置半小时，取其上层液体涂片，用结晶紫或石炭酸复红紫色镜检，如发现紫色或红色，呈波浪卷曲、两端尖锐，猪痢疾密螺旋体样微生物，且数量很多，每个视野3～5条以上，可疑为本病。但要注意与健康猪大肠中存在的小螺旋体或类螺旋体区别。类螺旋体较小，螺旋排列不规则，只有一个弯曲，两端钝圆，在血液琼脂上不产生溶血或弱β溶血，无致病性，易于辨认。此外，还要注意与形态上和猪痢疾密螺旋体相似的非致病性的无害密螺旋体(T．innocens简称T．i)区别。区别要点如下。
直接镜检法对急性后期，慢性或用药后的病例，检出率低。
(2)暗视野检查 取用生理盐水稀释的粪样1滴制成悬滴或压滴标本，于暗视野显微镜下检查，一般可见折光一致，活泼旋转运动的大型螺旋状微生物，但要注意与肠道中的小螺旋体或其他形态微生物区别。
3．分离培养 本菌为革兰氏阴性、厌氧性螺旋体，培养条件比一般细菌要高，必须在加有酪蛋白胰酶消化物豆胨血液琼脂，并在有H2和CO2以钯为触媒的条件下培养。
(1)直接划线法 将被检样品直接在上述血液琼脂培养基上划线分离，常因杂菌太多，较难分离成功。
(2)稀释法 将被检样品用PBS或生理盐水按10-1～10-6稀释，每管各取0．1ml，分别接种于加有壮观霉素的酪蛋白胰酶消化物豆胨血液琼脂上，于42℃或37℃培养3～6天，可见条状β溶血区，呈云雾点状表面生长，有时可见针尖状透明菌落。此时钓菌检查，可见疏松卷曲的大螺旋体。本菌生化反应不活泼，只能分解少数糖，如葡萄糖、麦芽糖。最终鉴定，尚需进行病原性和血清学特异性检查。但要注意血清型的问题，已知该菌有四个血清型，近年来国外尚有新的血清型报道。
(3)过滤法 将被检样品用PBS或生理盐水10倍稀释，低速离心，去渣，将上清液用0．65μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液接种于加有壮观霉素的选择培养基上，按上述方法进行培养、检查和鉴定。
4．动物试验 目的是测定猪痢疾密螺旋体的致病性。通常利用小白鼠、豚鼠、家兔和断奶猪作经口感染试验与肠结扎试验。
(1)经口感染试验 以低代次(15代以内)的猪痢疾密螺旋体的人工培养物经口感染小白鼠、豚鼠和断奶猪均可在1～2周内引起不同程度的肠炎，排出带血胨的粪便，此时粪检，常可查出大量的猪痢疾密螺旋体，此即证明为致病性菌株。
(2)肠感染试验 利用兔作回肠结扎试验，按一般外科手术方法，分段结扎回肠每段约5cm，间距2cm，试验肠段注入人工培养物约3ml，而对照肠段注入同量生理盐水，接种后48h剖检，如试验肠段鼓气明显，液体增多，肠粘膜肿胀充血，并有粘性渗出物，涂片检查可见到大量猪痢疾密螺旋体，证明此即为致病性菌株。有条件的最好利用断奶猪结肠结扎试验，效果较好。
5．血清学试验 猪在感染猪痢疾密螺旋体以后，常可在血清中查出循环抗体，因此进行血清学试验具有诊断意义。
(1)微量凝集试验 应用U形孔的微量反应板，先将被检血清用1%新生犊牛血清PBS作1∶8稀释，于56℃水浴中，灭活30min，再作倍比稀释，每孔0．05ml，然后每孔各加凝集抗原0．05ml，轻轻振动混匀后，置于38℃温箱中16～24h，判定结果，其凝集价一般病猪＞1∶32，健康猪＜1∶16。
(2)平板凝集试验 将被检血清用生理盐水按倍量法稀释为8～128倍，各取稀释液1滴(约0．02ml)放于有格玻璃板上，再加结晶紫平板凝集抗原1滴，随即振摇混匀，并观察结果，在室温条件下约15min，即可判定结果，判定标准同上。
(3)微量补体结合试验 本法敏感，特异性高。其操作方法：按常规法，先测定补体、溶血素和抗原效价，然后将被检血清应用巴比妥缓冲液稀释，再分别加入测好效价的补体，抗原和致敏的绵羊红细胞各1～2滴，置微型振荡器振荡2～3min，混匀后，置37℃水浴箱中，30min，观察结果，在一般对照管反应无误时，方可进行判断。血清最高稀释度达50%以上阻止溶血为其补反效价。病猪＞1∶4，健康猪＜1∶2。
(4)酶联免疫吸附(ELISA)试验 采取间接法，按以下步骤进行，将经过粉碎冻融的猪痢疾密螺旋体，可溶性抗原用包被液体适当稀释，以每孔0．2ml加入微量反应板各孔中，4℃致敏18h以上，次日弃去孔中抗原液，用洗涤液填满各孔，静置5min，弃去洗涤液，重复3次，最后一次弃去洗涤液后，空气中干燥，加入稀释的试验血清，每孔0．2ml，同时以阳性与阴性血清作为对照。每份血清均作双孔，置湿盒37℃孵育1h，同上洗涤3次，每孔加入工作浓度的酶标结合物0．2ml，置湿盒37℃孵育1h，同上洗涤3次，每孔加入新配制的底物液0．2ml，置温盒内37℃保温30min，每孔加入2mol／LH2SO41滴(约0．05ml)终止反应，利用酶标比色计测定各孔的光密度值(OD值)。根据华中农大猪痢疾科研组研究结果，以健康猪血清校正，平均光密度值
+2SD即OD≥0．27，可判为阳性。
(5)免疫荧光试验
①直接荧光抗体法 检查猪痢疾密螺旋体，可取病猪粪，制成涂抹标本，自然干燥，浸于丙酮液中，于4℃或室温固定10～15min后，立即用毛细管滴加1滴(约20μl)工作浓度的猪痢疾密螺旋体荧光抗体覆盖涂抹面，再将玻片移入有盖湿盒内，孵育30min，取出后，倾去多余荧光抗体液，于pH7．40．01mol／LPBS中漂洗约10min，换PBS两次，然后用蒸馏水漂洗约0．5min甩干后，加pH7．4缓冲甘油，盖上盖玻片，用荧光显微镜检查，猪痢疾密螺旋体可发出耀眼的黄绿色荧光。
②间接荧光抗体法 检查猪血清中的猪痢疾密螺旋体抗体。一般是先将已知型猪痢疾密螺旋体制成抗原片，再将被检血清56℃30min灭活，用pH7．4的PBS倍量稀释为2～256倍，分别滴加于抗原片上(同时作已知阳性与阴性血清对照)，放于37℃湿盒内作用30min使其特异结合，再用PBS洗15min(换液3次)干后滴加标记的兔抗猪荧光抗体，于37℃湿盒内染30min，用PBS洗15min(换液3次)，干后镜检，结果判定，间接荧光抗体效价≥1∶8为阳性，1∶4为可疑，＜1∶2为阴性。
(6)免疫琼脂扩散试验 将含Tris缓冲生理盐水配成的1%琼脂凝胶融化后，平铺于平皿内，并根据需要数量打孔，孔径6mm，孔间距离10mm，在中央孔加入琼扩抗原，周围孔加入被检血清，然后置湿盒内，37℃4～6h，再置室温6～18h，即可观察结果。根据沉淀线的有无，进行判定。
二、兔密螺旋体(Treponema cuniculi)
兔密螺旋体为兔梅毒的病原。主要通过交配传染，是兔的一种慢性传染病。以侵害外生殖器和颜面部的皮肤和粘膜，使其发生炎症、结节和糜烂为其病理特征。
病原特性和实验诊断方法如下。
1．样品采集 采取病变部皮肤挤出的淋巴液或包皮的洗出物。
2．显微镜检查 将采集样品涂片染色镜检，可发现大量纤细螺旋致密的兔密螺旋体，形态上和人梅毒的苍白密螺旋体相似。此种螺旋体着色困难，常用印度墨汁、姬姆萨、石炭酸复红和镀银染色。制成悬滴或压滴标本，用暗视野检查，可见其呈旋转运动。
3．分离培养与动物试验 兔密螺旋体为厌氧性螺旋体，迄今尚未人工培养成功。但用兔划痕法接种病料，可发生和自然感染相同的病灶。此螺旋体主要存在病兔外生殖器官病灶中。
4．其他试验 近来有的国家试用玻板凝集试验、血浆反应素纸片快速试验和密螺旋体荧光抗原等技术检查兔血清进行诊断，但尚处于试验阶段。